1. Estandarización de cultivos neuronales mediante dispositivos microfluídicos: Montaje de dispositivos
- Seleccione un dispositivo microfluídico adecuado para el experimento deseado. Para conectar neuronas dentro de la misma población, utilice los Dispositivos Neurológicos (Figura 1), y para conectar neuronas en diferentes poblaciones, utilice los Dispositivos de Cocultivo (Figura 2).
- Limpie y prepare el número deseado de cubreobjetos estériles o platos con fondo de vidrio. Para obtener los mejores resultados en superficies de plástico, use platos de 35 mm, sobre vidrio, use cubreobjetos de 25 mm o platos con fondo de vidrio de 35 mm. Seleccione el grosor del vidrio en función del sistema de imagen, por ejemplo, 0,15 mm.
- Cubra los platos o cubreobjetos con 0,5-1 mL de 100 μg/mL de PDL durante 2 h o toda la noche a temperatura ambiente><.
nota: El protocolo se puede pausar aquí y reanudar al día siguiente si se desea. Además, los platos pueden recubrirse con PDL diluido en tampón de borato, poli-L-lisina (PLL), laminina o cualquier otra molécula de adhesión celular.
- Lave los platos dos veces con agua (no utilice solución salina tamponada con fosfato (PBS) ya que los cristales de sal pueden bloquear los canales), retire todo el líquido y déjelo secar en un ambiente estéril como una cabina de bioseguridad durante 5-10 minutos o hasta que la superficie esté completamente seca.
nota: Tenga cuidado de asegurarse de que los cubreobjetos estén absolutamente secos, ya que cualquier líquido restante interferirá con la adherencia de los sistemas microfluídicos.
- Coloque los dispositivos microfluídicos con patrones hacia arriba bajo la luz ultravioleta en un ambiente estéril (cabina de bioseguridad) durante 10 min. Asegúrese de seguir los procedimientos estériles cuando trabaje en la cabina de bioseguridad10.
- Con unas pinzas, coloque un dispositivo microfluídico con un patrón hacia abajo en contacto con el cubreobjetos/plato limpio. Utilice las pinzas para presionar suavemente el dispositivo para que se adhiera al vidrio.
nota: La transparencia de la región adherida será visible cuando se mire a contraluz. Asegúrese de que todas las esquinas estén en contacto con el vidrio. Haga esto con todos los dispositivos microfluídicos. Véase la figura 1a.
- Para llenar el dispositivo de población única con medio, apunte la pipeta hacia los canales y agregue 50 μL de medio celular completo suplementado con B-27 sin suero (relación de volumen 1:50) y 500 μg/mL de penicilina/estreptomicina/glutamina (denominados colectivamente NBM) en el pocillo superior derecho, y luego agregue otros 50 μL al pocillo que se encuentra en diagonal a él. Haga esto para todos los dispositivos, asegurándose de que el medio fluya entre los pozos. A continuación, agregue 50 μL de medio a los dos pocillos restantes. Véase la figura 3a.
- Para llenar el dispositivo de población múltiple con medio, apunte la pipeta hacia los canales y agregue 30 μL de NBM completo a los pocillos correctos, consulte la Figura 2a. Haga esto para todos los dispositivos, asegurándose de que el medio fluya entre los pozos. A continuación, agregue 50 μL de medio a los cuatro pocillos restantes.
- Coloque los dispositivos en un plato más grande con un plato abierto con agua esterilizada en autoclave (cámara húmeda) y colóquelos en la incubadora (37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad) durante 1-2 h mientras prepara el cultivo celular. Véase la figura 3b.
2. Recubrimiento de neuronas en sistemas microfluídicos
- Siguiendo un protocolo, obtenga neuronas corticales o del hipocampo disociadas de embriones de rata Sprague Dawley (de ambos sexos).
- Resuspender las neuronas embrionarias en NBM a una concentración de 1-2 millones de neuronas/mL. Verifique las concentraciones celulares en el microscopio utilizando un hemocitómetro y siguiendo la referencia8. Ajuste la concentración de células de acuerdo con la densidad de células deseada. Para aumentar las posibilidades de obtener axones individuales del hipocampo por canal, coloque 10.000 neuronas por dispositivo. Para tener varios axones en el mismo canal, hay que colocar 60.000 neuronas por dispositivo
Nota: Estos números varían según el tipo neuronal utilizado.
- Retire el medio de los dispositivos microfluídicos sin vaciar los pocillos. Deje aproximadamente 5 μL en cada uno.
- Para colocar células en placas en el dispositivo de población única, agregue 50 μL de NBM en el pocillo inferior derecho. En este punto, el medio fluye por sí mismo para llenar el otro pozo inferior. Agregue 20 μL de la solución de celda concentrada en el pocillo superior derecho del dispositivo microfluídico, como se indica en la Figura 1b.
- Para colocar las células en placa en el dispositivo de población múltiple, agregue 20 μL de la solución de celda concentrada en cada uno de los pocillos correctos en la Figura 2a.
- Compruebe en el microscopio si hay células dentro de las cámaras y coloque los dispositivos en la incubadora durante 15-30 minutos para promover la unión de las células al sustrato.
- Compruebe en el microscopio si hay suficientes células en las cámaras. Si se necesitan más, repita los pasos 2.4 y 2.5.
- Agregue 50 μL de NBM a los 2 pocillos superiores del dispositivo de población única y 20 μL de NBM en el mismo pocillo en el que se inyectaron las células en el dispositivo de población múltiple. El medio sobresale ligeramente para formar un menisco positivo que le da a los pocillos un aspecto de muffin. De nuevo, consulte la Figura 3a.
- Mantenga las celdas a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad.
>3. Mantenimiento de los cultivos neuronales
- Retire el NBM (aproximadamente 30 μL con una pipeta) de las células y aplique un nuevo NBM precalentado al día siguiente de su introducción en los dispositivos (es decir, 1 día después del paso 2).
- Compruebe cada 2 días si hay suficiente medio en cada canal. Si la parte superior del muffin está baja, simplemente agregue más medio a los pozos superiores.
- Cultive las células durante al menos 7 días antes de retirar los dispositivos microfluídicos. Las células pueden sobrevivir en estos dispositivos durante varias semanas. Retire los dispositivos 1-2 días antes de realizar los experimentos con las muestras.
>4. Eliminación de dispositivos microfluídicos
- 1 - 2 días antes de retirar los dispositivos microfluídicos, añadir 2 mL de NBM precalentado a 37 °C a cada placa de muestra, inundando las cámaras, y mantener los dispositivos en la incubadora.
- Utilice pinzas estériles y una punta para retirar los dispositivos microfluídicos de los cubreobjetos, dejando una configuración de neuronas con patrón. Use la punta para mantener el cubreobjetos en su lugar y las pinzas para sujetar el borde del dispositivo en la esquina inferior izquierda del pozo. Aplique delicadamente la torsión, levantando el dispositivo con las pinzas para que se despegue del cubreobjetos. Véase la figura 3c-3d.
- Cada 2-3 días, reemplace la mitad del NBM hasta que la muestra se utilice para experimentos.
- Antes de realizar experimentos de recableado en la muestra, verifique que las neuritas en los canales del dispositivo de población única y las poblaciones neuronales en el dispositivo de población múltiple estén aisladas examinando los espacios entre ellas en el microscopio para asegurarse de que no haya filamentos que unan las poblaciones neuronales.
>5. Preparación de cuentas recubiertas de PDL
- Añadir 2 gotas de 50 μL de 4, 10 o 20 μm de perlas de poliestireno diluidas en agua (1:500) a 1 mL de PDL (100 μg/mL). Dejar actuar al menos 2 h a temperatura ambiente.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y reanudar al día siguiente.
- Centrifugar la solución a 8.820 x g durante 1 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas acumuladas en el fondo del recipiente.
- Lave las perlas dos veces con 1 mL de solución estéril de 10 mM de HEPES pH 8.4.
- Vuelva a suspender las perlas recubiertas de PDL en 200 mL de solución de 10 mM de pH 8,4 de HEPES.
>6. Preparación de micropipetas
- Prepare pipetas a partir de tubos capilares de vidrio (1 mm de diámetro interior, 1,5 mm de diámetro exterior) utilizando un extractor de electrodos horizontal. Ajuste la configuración para que la punta exterior de la micropipeta extraída sea de ~ 2-5 μm. Antes de tirar, asegúrese de que los tubos de vidrio estén limpios.
- Fije las pipetas a los portaobjetos de vidrio para su almacenamiento y asegúrese de que la punta no entre en contacto con la superficie del portaobjetos, ya que la punta es frágil. Almacene a temperatura ambiente en un recipiente tapado para protegerlo del polvo. Use las pipetas el mismo día que se extraen.
>7. Adhesión de la perla PDL a las neuronas
- Añadir 40-60 μL de perlas recubiertas de PDL preparadas en el paso 5 a un cultivo celular preparado en el paso 4. Centre la punta de la pipeta sobre las neuronas, que son débilmente visibles en el cubreobjetos, y agregue las perlas (consulte la figura 4).
- Regrese la muestra a la incubadora durante 1 h para promover la formación de contactos sinápticos.
- Después de la incubación, retire las perlas no adheridas lavando suavemente el cultivo con NBM precalentado.
>8. Preparación de una solución salina fisiológica (para experimentos a temperatura ambiente)
- Prepara una solución salina fisiológica. Esto es para regular el entorno de la célula fuera de la incubadora.
- Verifica la osmolaridad y los niveles de pH.
- Infundir continuamente la solución con O2 para minimizar las fluctuaciones del pH mientras se realizan experimentos.
- Calentar a temperatura ambiente.
- Configure el sistema de perfusión insertando un extremo de un tubo de plástico (dimensiones opcionales) en una solución fisiológica infundida con O2 y fijando el otro extremo a una aguja insertada en el portamuestras. Coloque el tubo y la solución más alto que la muestra (consulte la Figura 5).
- Desconecte el tubo de la aguja y conéctelo a una jeringa. Use la jeringa para ejercer presión y extraer líquido, llenando el tubo. Selle con una abrazadera de rodillo y vuelva a conectar la aguja.
>9. Micromanipulación de cuentas
- Instale la muestra en una configuración experimental de modo que se pueda acceder a las células desde arriba mediante dos micropipetas montadas en micromanipuladores y acceder ópticamente por debajo, por ejemplo, con el objetivo de fase 40X (apertura numérica de 0,6) de un microscopio óptico invertido. En esta configuración, monte una cámara CCD para la captura de imágenes en el puerto lateral del microscopio. Conecte cada pipeta a jeringas de 1 ml a través de un tubo de plástico. En este paso, reemplace el NBM con una solución salina fisiológica (1-2 mL) (ver Figura 5).
- Durante los experimentos, las células perfundidas continuamente con la solución salina fisiológica preparada en el paso 8 a una tasa de 0,5-1 mL/min.
- Seleccione una cuenta PDL NO conectada a una neurona en el campo de visión. Alinee el cordón con la punta de una micropipeta enfocándose en el cordón y, a continuación, suba hasta la micropipeta. Lleve la punta lo más cerca posible de la cuenta monitoreándola a través del microscopio.
- Aplique presión negativa con la jeringa de 1 ml conectada a la pipeta para recoger la perla. Mantén la presión negativa durante todo el experimento.
10. Tirando de neuritas
- Seleccione una perla de PDL conectada a una neurona en el campo de visión y conéctela a la segunda micropipeta mediante succión como se describe en los pasos 9.3-9.4.
- Tire lentamente del complejo PDL-perla-neurona (~0,5 μm/min), moviendo el micromanipulador o la etapa de muestra 1 μm y haciendo una pausa de 5 minutos para permitir la iniciación de la neurita.
- Repita el paso 10.2 dos veces.
Nota: Las primeras 3 μm deben extraerse muy lentamente para garantizar el éxito experimental, lo que ocurre más del 95% de las veces.
- Tire del complejo PDL-perla-neurona moviendo lentamente (~0,5 μm/min) el micromanipulador o la etapa de muestra 2 μm y haga una pausa de 5 minutos para permitir el alargamiento de la neurita.
- Después de iniciar con éxito y extender la neurita durante los primeros 5 μm, tire de la neurita a 20 μm/min a distancias de escala milimétrica.
Nota: El tirón se puede realizar de forma continua o en pasos y a velocidades variables. Vea la Figura 6b-6c.
11. Conectando neuronas
- Seleccione una región rica en neuritas y reduzca el complejo PDL-perla-neurita para que entre en contacto físico con ella. Use otras cuentas para medir la altura de la punta por encima de la superficie del cubreobjetos. Véase la figura 6d.
- Deje el complejo PDL-perla-neurita en contacto con la neurita objetivo mientras manipula la segunda micropipeta. Baje la segunda pipeta con el segundo cordón PDL sobre la neurita recién formada a unos 20 μm del primer cordón. Utilice la segunda perla PDL para empujar el nuevo filamento de neurita hacia la célula objetivo.
- Mantenga ambas perlas en su lugar durante al menos 1 h. Verifique con el microscopio la ausencia de hinchazón focal, un engrosamiento de las neuritas que entran en contacto con la perla16.
- Durante este tiempo, utilice la perfusión para cambiar lentamente el medio de la muestra de solución salina fisiológica a NBM precalentado y equilibrado conCO2.
- Suelte el cordón de la segunda pipeta liberando la succión. Si la nueva neurita permanece adherida, suelte también la primera cuenta. Véase la figura 6e.
- Retire suavemente la solución salina y reemplácela con NBM (~ 2 mL).
- Vuelva a colocar con cuidado la muestra en la incubadora para fortalecer la conexión neuronal para futuros experimentos. Esta conexión es estable durante >24
