Generación de neuronas mediante la reprogramación de células de fibroblastos dérmicos humanos

Resumen

Fuente: Shrigley, S., et al. Generación simple de un cultivo de alto rendimiento de neuronas inducidas a partir de fibroblastos de piel adultos humanos. J. Vis. Exp. (2018)

El video muestra la generación de neuronas a partir de fibroblastos dérmicos humanos adultos (aHDF). Los aHDFs se reprograman utilizando un vector lentiviral portador de genes para factores de transcripción neuronal y ARN de horquilla corta (shRNAs). Los shRNAs inhiben la expresión de un represor transcripcional neuronal, y los factores de transcripción neuronal activan genes para diferenciar las aHDFs en neuronas. Estas aHDFs reprogramadas se cultivan en un medio de conversión neuronal temprana y tardía para generar neuronas maduras.

Protocolo

1. Preparación de fibroblastos cutáneos para la reprogramación

1. Utilizando un sistema automatizado de descongelación celular o un baño de agua a 37 °C, descongele los fibroblastos dérmicos humanos adultos (aHDF) y coloque una placa de 200.000 por matraz T75 (cuente con un contador de células automatizado) en 10 mL de medio fibroblasto (ver Tabla 1) a 37 °C en CO₂ al 5%.
2. Realice un cambio completo del medio con medio fibroblasto al día siguiente.
3. Cambie el medio de fibroblastos cada 3-4 días hasta que las células alcancen el 95% de confluencia.
   nota: Un matraz confluente contendrá aproximadamente 1.000.000 de células.

>2. Enchapado para reprogramación (Día −1)

NOTA: Se recomienda utilizar un recubrimiento de gelatina para experimentos a corto plazo (hasta 30 días); alternativamente, para experimentos a largo plazo se recomienda comenzar con un recubrimiento de poli-L-ornitina, fibronectina y laminina (PFL).

1. 60 minutos antes de enchapar los aHDF para su reprogramación, cubra una placa de 24 pocillos con gelatina al 0,1 % (250 μL/pocillo) e incube a 37 °C.
2. Aspire el medio fibroblasto en los aHDF. Lavar una vez con la solución salina tampón de fosfato (DPBS) de Dulbecco. Disociar las células con tripsina al 0,05% (1,5 mL por matraz T75) a 37 °C durante 3–5 min.
3. Añada medio fibroblasto para neutralizar la tripsina (3 mL por lavado por matraz T75) y recoja las células desprendidas en un tubo de 15 mL enjuagando las células del matraz dos veces.
4. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en 1 mL de medio fibroblasto.
5. Cuente las células utilizando un contador de células automatizado (para garantizar una conversión de buena calidad, compruebe que la viabilidad de las células esté por encima del 90% con tinción con azul de tripán).
6. Para una placa completa de 24 pocillos, prepare una suspensión de 1.320.000 células en 13,2 ml de medio fibroblasto para lograr una suspensión de 100.000 células/ml de medio (o 55.000 células/pocillo en 550 μl de medio fibroblasto multiplicado por el número de pocillos necesarios).
7. Aspire la gelatina del plato y lave dos veces con DPBS. Añadir 500 μL de la suspensión celular a cada pocillo e incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂.

>3. Transducción viral (Día 0)

NOTA: Trabajar con partículas lentivirales requiere un equipo de categoría 2 y el uso de un agente para neutralizar el virus. También se recomienda encarecidamente el uso de pares dobles de guantes.

1. Calentar 13,2 mL de medio fibroblasto a 37 °C.
2. Descongele un vector lentiviral que contiene los factores de transcripción achaete-scute, bHLH factor de transcripción 1 (Ascl1) y Brn2 con dos ARN de horquilla corta (shRNA) dirigidos al factor de transcripción silenciador RE1 (REST) a temperatura ambiente.
3. Agregue el volumen necesario de lentivirus para infectar los aHDFs a una multiplicidad de infección (MOI) de 20 al medio sin ningún potenciador de la transducción.
   
4. Sustituya el medio de la placa de 24 pocillos por un medio de fibroblastos que contenga el vector lentiviral (500 μL/pocillo) e incube durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂.
5. Al día siguiente, reemplace el medio en los pocillos con medio de fibroblastos fresco sin el vector lentiviral.
   nota: El medio se considera infeccioso durante 7 días y, como tal, se deben utilizar procedimientos adecuados de protección y manipulación durante la primera semana después de la transducción viral.

>4. Mantenimiento de las células de conversión

NOTA: Una vez que comienza la conversión, las células son susceptibles de levantarse; tenga cuidado de inclinar la placa hacia arriba y utilice una pipeta de 1.000 μL al retirar el medio para evitar que las células se desprendan.

1. El día 3, retire el medio fibroblasto y agregue 500 μL de medio de conversión neuronal temprana (ver Tabla 1).
2. Dos o tres veces por semana, saque 225 μL de medio viejo del pocillo y agregue 250 μL de medio fresco de conversión neuronal temprana.
3. El día 18, retire todo el medio de cada pocillo y reemplácelo con 500 μL de medio de conversión neuronal tardía (ver Tabla 1).
4. Continúe cambiando la mitad del medio como se indicó anteriormente con el medio de conversión neuronal tardía cada 2-3 días hasta el día 25 o el punto final del experimento (Figura 1A).

Tabla 1. Composición de los diferentes medios utilizados. Descripción completa de la composición de los medios necesarios en este protocolo, incluido el medio de fibroblastos, el medio de conversión neuronal temprana, el medio de conversión neuronal tardía.

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	Concentración de existencias	Concentración de trabajo
Medio de fibroblastos
Medio basal	N/A	N/A
Penicilina/Estreptomicina	10,000 U/mL	100 mg/mL
FBS	N/A	10%
Medio de conversión neuronal temprana (ENM)
Medio de diferenciación neuronal	N/A	N/A
Penicilina/Estreptomicina	10,000 U/mL	100 mg/mL
CHIR99021	10 mM	2 μM
SB-431542	20 mM	10 μM
Cabeza	100 μg/mL	0,5 μg/mL
LDN-1931189	10 mM	0,5 μM
AVA	1 M	1 mM
LM-22A4	20 mM	2 μM
GDNF (en	20 μg/mL	2 ng/mL
NT3	10 μg/mL	10 ng/μL
db-cAMP	50 mM	0,5 mM
Medio de conversión neuronal tardía (LNM)
Medio de diferenciación neuronal	N/A	N/A
Penicilina/Estreptomicina	10,000 U/mL	100 mg/mL
LM-22A4	20 mM	2 μM
GDNF (en	20 μg/mL	2 ng/mL
NT3	10 μg/mL	10 ng/μL
db-cAMP	50 mM	0,5 mM

Resultados

Figura 1: Evolución de la conversión iN a lo largo del tiempo.(A) Cronología del experimento y mapa del constructo empaquetado en un lentivirus utilizado para reprogramar los fibroblastos dérmicos humanos adultos. Cada flecha negra representa un cambio medio. (B) Imágenes representativas de contraste de fase que representan los cambios en la morfología de las células...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Líneas celulares
Fibroblastos dérmicos humanos adultos			[Pasaje C2 #7] La donante fue una mujer de 67 años. Células obtenidas de las clínicas de Investigación de la Enfermedad de Parkinson y de la enfermedad de Huntington en el Centro John van Geest para la Reparación del Cerebro (Cambridge, Reino Unido).
Reactivos para cultivo, transducción y conversión de fibroblastos
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	Gibco	14190094
Tripsina-EDTA [0,5%]	Gibco	15400-054	Diluir al 0,05% en DPBS.
Virkon (agente utilizado para neutralizar virus)	Viroderm	7511	Diluya a una solución al 1% con agua tibia.
Agua Milli-Q	Millipore
Medio basal - Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) + GlutaMax	Gibco	61965059
Penicilina/estreptomicina [10,000 U/ mL]	Gibco	Números 15140-122
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	10270-106
CrioMACS® dimetilsulfóxido (DMSO) 10	Miltenyi	170-076-303
Medio de diferenciación neuronal - NDiff 227	Takara-Clontech	Y40002
LM-22A4	Tocris	4607	Diluir 10 mg en 1450 μL DMSO. Concentración de stock: 20 mM.
Factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF) [humano recombinante]	Sistemas de investigación y desarrollo	212-GD-010	Diluir 10 ug en 500 μL 0,1% BSA en DPBS. Concentración de stock: 20 μg/mL.
NT3 [humano recombinante]	Sistemas de investigación y desarrollo	267-N3-025	Diluir 25 μg en 2,5 mL 0,1% BSA en DPBS. Concentración de material: 10 μg/mL.
db-cAMP	Sigma Aldrich	D0627	Diluir 1 g en 40,7 mL de agua Milli-Q. Filtrar y hacer alícuotas de 500 μL o tubos de stock de 10 mL. Concentración de stock: 50 mM.
CHIR99021	axón	Año 1386	Diluir 2 μg en 429,8 μL DMSO. Concentración de stock: 10 mM.
LDN-193189	axón	Año 1509	Diluir 2 mg en 360 μL DMSO. Concentración de stock: 10 mM.
Sal sódica del ácido valproico (VPA)	Merck Millipore	676380	Diluir 5 g en agua Milli-Q para lograr una concentración de caldo de 1 M. PRECAUCIÓN: Evite la ingestión, el contacto con la piel y la formación de polvo al respirar.
Reactivos para recubrimientos
gelatina	Sigma Aldrich	G2500	Diluir al 0,1% en agua Milli-Q.
Poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	P3655	Disolver en agua Milli-Q. Úselo a 15 μg/mL.
Fibronectina	ThermoFisher Scientific	33010-018	2 mL de agua Milli-Q + 70 μL 0,25 M de NaOH. Usar a 5 μg/mL.
Laminina	ThermoFisher Scientific	23017-015	Conservar a -80 °C. Descongelar en hielo, mantener en frío y alícuota 30 μL. Utilizar a 5 μg/mL.
equipo
Matraz T75 [Nunclon Delta Surface]	ThermoFisher Scientific	156499
Placa de 24 pocillos [Nunc]	ThermoFisher Scientific	142485
Tubo de polipropileno de 1,5 mL	Sigma Aldrich	Z336769
Tubo falcon de 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
Tubo halcón de 50 mL	Sarstedt	6,25,47,254
Controlador de Pippette			Para volúmenes de pipeteo de 1 a 25 mL.
Pipetas serológicas estériles: 5, 10 y 25 mL	Sarstedt	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Pipetas de volumen ajustable: 5, 20, 200 y 1.000 μL
Puntas de pipeta estériles			Para volúmenes de pipeteo de 0,5 - 1.000 μL.
Sistema automatizado de descongelación de celdas ThawSTAR	BioCision	BCS-601
Contador de células automatizado Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000
Cámaras de recuento de células [50 portaobjetos] y azul de tripán [0,4%]	ThermoFisher Scientific	C10228	Para usar con el contador de células automatizado Countess II.
Campana de flujo laminar
Incubadora humidificada 5% CO2 37 °C
centrífuga			Apto para tubos de 1,5, 15 y 50 mL.
Agitador orbital
Microscopio de fluorescencia invertida	Leica	DMI6000 B