Generación y mantenimiento de cultivos de cortes a partir de tejido de glioblastoma humano

Resumen

Fuente: Parker, J. J., et al. Un modelo de cultivo de corte organotípico de glioblastoma humano para el estudio de la migración de células tumorales y los efectos específicos del paciente de los fármacos antiinvasivos. J. Vis. Exp. (2017).

El video muestra la generación y el mantenimiento de cultivos de cortes organotípicos a partir de tejido de glioblastoma. El tejido aislado se incrusta en una matriz de agarosa y se obtienen secciones delgadas utilizando un vibrátomo. A continuación, estas secciones se colocan en insertos de membrana permeable dentro de una microplaca y se cultivan en un medio de mantenimiento de cultivo en rodajas para el mantenimiento a largo plazo.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación previa al corte

1. Prepare los medios de "procesamiento de tejidos" y los medios de "mantenimiento de cultivo en cortes" el día antes de la resección tumoral planificada y la recolección de tejido (o utilice los medios generados previamente dentro de las 2 semanas). Agregue 5 mL de solución de penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) y 5 mL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico (HEPES) a 500 mL de un medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM) para generar el medio de procesamiento de tejidos.
2. Prepare 250 mL de medio de mantenimiento de cultivo en rodajas utilizando una base de medio neuronal (por ejemplo, Neurobasal) sin rojo de fenol. Complemente este medio con 10 mM de HEPES, 1x suplemento de B-27, 400 μM de L-glutamina, 600 μM de dipéptido de L-alanil-L-glutamina, 60 U/mL de penicilina, 60 μg/mL de estreptomicina y 6 U/mL de nistatina.
3. Almacene todos los medios a 4 °C durante no más de 2 semanas.

>2. Día de la Cirugía: Adquisición de Tejido

1. El día de la adquisición del tejido, prepare de 50 a 100 mL de soluciones de agarosa al 1% y al 2% (peso/vol%) en medios de procesamiento de tejidos utilizando cristalería esterilizada en autoclave y técnica estéril en una campana de flujo laminar. Ambas concentraciones de agarosa son necesarias para acomodar la variación impredecible en la consistencia del tejido tumoral.
2. Calentar la suspensión de agarosa, usando un microondas, hasta que se observe una ebullición suave. Coloque la solución de agarosa en un baño de agua a 37 °C para mantenerla en estado líquido hasta su uso.
3. Coloque 1 mL de medio de mantenimiento de cultivo en rodajas en cada pocillo de una placa de 6 pocillos.
4. Use una pinza estéril para colocar insertos vacíos de cultivo de politetrafluoroetileno (PTFE) en cada pocillo. Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada, encamisada con agua, con una atmósfera de 5% de CO₂ mantenida a 37 °C.
5. Con una pipeta Pasteur estéril en una campana de flujo laminar, burbujee una mezcla de gas O₂/5% CO₂ al 95 % en un matraz que contenga medios de procesamiento de tejido helado durante aproximadamente 15 a 30 minutos, antes de la adquisición del tejido tumoral. El uso de medios supraoxigenados minimiza la hipoxia en el tejido a granel durante el procesamiento.
6. Prepare tubos cónicos de 50 mL marcados (suficientes para el número deseado de regiones tumorales individuales que se van a aislar) que contengan alícuotas de 20 mL de medios de procesamiento helados supraoxigenados para transportar tejido entre el quirófano y la instalación de corte.
7. Junto con un neurocirujano, planifique preoperatoriamente la región tumoral para la adquisición de muestras. Seleccionar una región tumoral con realce de contraste como se muestra en las imágenes clínicas del paciente (secuencias de imágenes de resonancia magnética [IRM] posteriores al gadolinio T1). La experiencia previa sugiere que esta área produce tejido tumoral viable en lugar de tejido necrótico
   nota: Se intentó la generación de cortes a partir de la sustancia blanca circundante (peritumoral); Sin embargo, la autofluorescencia de fondo y la disminución de la densidad de células tumorales limitaron la utilidad experimental de estos cortes.
8. Obtener tejido tumoral hacia el comienzo de la resección tumoral. Evite la recolección de tejido tumoral expuesto a cauterización bipolar extensa, que puede comprometer la viabilidad del tejido secundario a una lesión térmica. Las muestras de tejido obtenidas durante la resección tumoral fragmentada muestran una mayor viabilidad en comparación con el tejido obtenido de resecciones prolongadas en bloque. Esta observación puede relacionarse con la privación diferencial del flujo sanguíneo del tejido tumoral como resultado de la resección quirúrgica y el tiempo prolongado hasta la adquisición.
9. Si lo desea, etiquete y almacene el tejido tumoral en tubos cónicos separados para aislar muestras de distintas regiones tumorales. (es decir, tejido tumoral superficial vs. tejido tumoral profundo). Se pueden registrar las ubicaciones precisas de los tejidos si se dispone de navegación quirúrgica intraoperatoria.

>3. Preparación del cultivo en rodajas

1. Coloque los trozos de tejido tumoral en una placa de Petri con medios de procesamiento helados. Para lavar el tejido tumoral y minimizar los glóbulos rojos adheridos, use una pipeta para intercambiar suavemente y desechar los medios en la placa de Petri tres veces.
2. Con un bisturí, corte los pedazos del tumor en forma de caja rectangular. Recorta las piezas de tejido hasta aproximadamente 3 mm x 3 mm x 10 mm. Retire con cuidado cualquier vaso adherido mediante escisión o tracción suave con pinzas finas.
3. Pipetear 5 - 7 mL de agarosa a 37 °C en un pequeño molde de plástico en forma de cubo (~ 2 cm³). Confirme que la temperatura de la solución de agarosa no sea superior a 37 °C con un termómetro estéril antes de usarla.
4. Deje reposar la agarosa durante aproximadamente 1 minuto sobre un lecho de hielo.
5. Coloque de 2 a 4 "tiras" de tejido tumoral en agarosa con el eje largo orientado verticalmente. nota: Las tiras de tejido tenderán a "hundirse" en la agarosa antes de la solidificación. Para evitar esta complicación, sostenga temporalmente la tira de tejido en orientación vertical hasta que la agarosa se solidifique aún más.
6. Mantenga el tejido que contiene moho de agarosa sobre un lecho de hielo durante 2 a 5 minutos para facilitar la solidificación.
7. Retire el molde del hielo y retire suavemente el bloque de agarosa cortando los lados del molde con un bisturí. Evite ejercer una fuerza excesiva sobre el bloque, ya que puede fracturar la agarosa.
8. Use una gota generosa de pegamento de cianoacrilato para fijar el bloque de agarosa a la placa de muestra del vibratomo. Deje que el pegamento se asiente durante aproximadamente 1 a 2 minutos.
9. Llene el depósito de vibratomo con medios de procesamiento helados para sumergir el bloque de agarosa adherido a la placa de muestra.
10. Durante el corte, burbujee la mezcla de gas 95% O₂ / 5% CO₂ en el depósito de vibratomo a través de una pipeta de plástico estéril recortada.
11. Ajuste el grosor de la rebanada del vibratomo a 300 - 350 μm.
12. Ajuste la velocidad de avance de la cuchilla y la amplitud de la cuchilla de acuerdo con la consistencia del tejido. El tejido de glioblastoma "más rígido" requiere velocidades de avance de la cuchilla más lentas y mayor amplitud. Los ajustes exactos de velocidad y amplitud de la cuchilla variarán según las especificaciones del vibratome.
    nota: Suelen surgir varios problemas durante el corte. Si la tira de tejido se desprende del bloque de agarosa, intente incrustar el tejido en una concentración más alta de agarosa. Si los cortes tumorales son más gruesos de lo deseado (ajustados a máquina) o son asimétricos, aumente la amplitud y disminuya la velocidad de la cuchilla del vibratomo. Para asegurarse de que el tejido tumoral no se pegue o sea "arrastrado" por el soporte de la cuchilla, a medida que se produce el corte, coloque con cuidado la microespátula entre el soporte de la cuchilla y el corte, a medida que la cuchilla se mueve.
13. Transfiera las rodajas de papel tisú a una placa de Petri con medios de procesamiento helados utilizando una microespátula de acero inoxidable.
14. Obtenga placas de 6 pocillos que contengan insertos de PTFE y medios de cultivo de cortes equilibrados de la incubadora (como se preparó en la sección 2, paso 4).
15. Laminar las rodajas de papel tisú con una microespátula de acero inoxidable. Minimice el contacto directo y la manipulación del tejido mediante el uso de un pincel pequeño de cerdas finas para generar una "onda fluida" para empujar suavemente la rebanada de la espátula y sobre el inserto >nota: Minimice la cantidad de medios de procesamiento introducidos en la parte superior del inserto de cultivo de tejidos. Si se transfieren cantidades excesivas de medio y las rodajas flotan, utilice una pipeta Pasteur estéril para eliminar el medio.
16. Regrese las placas de 6 pocillos que contienen cortes de tumor a una incubadora mantenida a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO₂.
    nota: Todo el protocolo de inclusión y corte debe completarse dentro de los 90 minutos posteriores a la adquisición del tejido tumoral desde el quirófano.

>4. Mantenimiento de la cultura de corte

1. Después de 12 a 24 h, transfiera los cultivos en rodajas agarrando cada borde del inserto con una pinza estéril y transfiéralos a placas que contengan medios de mantenimiento de cultivo en rodajas frescas. Asegúrese de que los medios de mantenimiento del cultivo de rebanadas acanalados en cada pocillo se equilibren en la incubadora durante al menos 15 minutos antes de transferir los insertos.
2. Mueva los insertos a nuevas placas de 6 pocillos con medios de cultivo de rebanadas frescas y equilibradas cada 48 h.
3. Si lo desea, alícuota los medios de cultivo de rodajas viejas con una pipeta para su uso inmediato en ensayos bioquímicos o congelarlos a -80 °C para su uso futuro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM Alto Glucosa	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Medio Neurobasal-A, menos rojo fenol	Invitrogen (Gibco)	12349-015
Suplemento B-27 (50x), sin suero	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicilina-estreptomicina (10.000 u/mL)	Invitrogen (Gibco)	Números 15140-122
Suplemento GlutaMAX	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamina (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Suspensión de nistatina	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10.000 unidades/mL en DPBS, procesado asépticamente, BioReactivo, apto para cultivo celular
Agarosa ultrapura de bajo punto de fusión	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Se funde a 65,5 °C, permanece fluido a 37 °C y se fija rápidamente por debajo de 25 °C.
Molde de incrustación Peel-A-Way (cuadrado - S22)	Policiencias, Inc.	18646A-1	Moldes para la inclusión de muestras tumorales
Micro espátulas de acero inoxidable	Fisher Científico	S50823	Doble el instrumento 45 grados en el cuello de la hoja de la cuchara
Pinzas curvas de disección de punta fina de Fisherbrand	Fisher Científico	08-875
Hoja de afeitar de un solo filo (maquinillas de afeitar de seguridad americanas)	Fisher Científico	17-989-001	El borde de la hoja tiene un grosor de 0.009". La cubierta de borde romo engarzado se retira antes de cargarla en el vibrátomo.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Inserto de cultivo celular de PTFE hidrófilo	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, PTFE hidrófilo, tamaño de poro de 0,4 μm
Platos con fondo de vidrio de 35 mm	MatTek	Manguito P35G-1.5-20-C	Vidrio de 20 mm de diámetro. Espesor del vidrio de cubreobjetos 1,5 mm
Incubadora de escenario PECON	PeCON Alemán	(Descontinuado)	La incubadora PM 2000 RBT es un producto comprable diseñado para su uso con microscopios Zeiss.