Desarrollo de un modelo de cultivo celular triple de la barrera hematoencefálica humana

Resumen

Fuente: Fattakhov, N., et al. Un modelo de cultivo celular primario triple de la barrera hematoencefálica humana para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico in vitro. J. Vis. Exp.(2022)

Este video demuestra el co-cultivo de células pericitarias, astrocitos y endoteliales del cerebro humano. Cada capa celular se forma por separado y luego se cultiva junta, creando un sistema de tres capas que imita la disposición celular de la barrera hematoencefálica

Protocolo

1. Ajuste del modelo BBB de cultivo celular triple

1. Siembra de pericitos
   1. Cultivar HBVP (pericitos vasculares del cerebro humano) en matraces de cultivo T75 con una superficie activada para la adhesión celular dentro de una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C hasta que confluente. Una vez alcanzada la confluencia, aspirar el medio pericitario antiguo y lavar las células con 5 mL de solución salina tibia tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Aspire el DPBS y separe las células del matraz utilizando una combinación de 4 mL de solución tibia de tripsina-EDTA y 1 mL de DPBS.
      NOTA: Evite usar pasajes posteriores a P7.
   2. Incubar el matraz durante 5 min a 37 °C en una incubadora de_CO2. Observarlo al microscopio para confirmar si las células se han desprendido del matraz. Añada 5 mL de medio pericitario tibio (que contenga un 2% de suero fetal bovino [FBS]) al matraz y transfiera las células desprendidas a un tubo de centrífuga de 50 mL.
   3. Centrifugar la suspensión celular durante 3 minutos a 200 × g, permitiendo que las celdas formen una bolita en el fondo del tubo. Aspire el medio del tubo, asegurándose de que el gránulo de la célula permanezca intacto.
   4. Vuelva a suspender el pellet de la célula en el medio pericito; calcule la cantidad de medio en función de la confluencia de las células y del número de insertos de pocillos necesarios. Tome 10 μL de las células resuspendidas, colóquelas en un portaobjetos de recuento de células y cuente el número de células.
   5. Determine la densidad celular y siembre 300.000 células/inserto en 1 mL de medio pericitario en el lado abluminal de los insertos de pocillos (formato de 6 pocillos).
      nota: Al sembrar HBVP en la parte inferior de los insertos, es importante voltear las placas de los insertos de pozo al revés. Mientras la placa se coloca plana sobre una superficie, retire la sección inferior para exponer el lado abluminal de los insertos del pocillo. Cubra los insertos de los pocillos con la placa volteada después de agregar la suspensión de células de pericito en el lado abluminal para evitar la evaporación. Mantenga todas las placas boca abajo en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante la noche.
2. Siembra de astrocitos
   1. Cultivar HA (astrocitos humanos) en frascos T75 dentro de una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C hasta alcanzar la confluencia. Siga los pasos anteriores 1.1.1-1.1.4 utilizando medio de astrocito (que también contiene 2% de FBS) en lugar de medio de pericito.
      NOTA: Evite usar pasajes posteriores a P9.
   2. Determine la densidad celular y siembre 300.000 células/pocillo en el fondo de las placas de 6 pocillos del cultivo de tejidos. Cubra la placa para evitar la evaporación y mantenga todas las placas en una incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C durante la noche.
3. Siembra de células endoteliales
   1. Cultivar HBMEC (células endoteliales microvasculares del cerebro humano) en placas de cultivo de tejidos dentro de una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C hasta que confluya. Siga los pasos anteriores 1.1.1-1.1.4 utilizando un medio clásico completo (que contenga un 10% de FBS) en lugar de un medio pericitato.
      nota: Evite usar pasajes posteriores a P12.
   2. Extraiga las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos que contienen astrocitos y los insertos de pocillos (formato de 6 pocillos) que contienen pericitos de la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C. Aspire el medio de astrocitos de las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Agregue 1 mL de medio pericitario y 1 mL de medio astrocito a cada pocillo.
   3. Aspire el medio pericitario de los insertos de pocillos y colóquelo en las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos que contienen los astrocitos sembrados. Siembre HBMEC a una densidad de 300.000 células/pocillo en 2 mL del medio clásico completo en el lado apical de los mismos insertos de pocillos.
      nota: Las células endoteliales deben sembrarse en el lado apical de los pocillos al día siguiente después de sembrar los pericitos en el lado abluminal de los pocillos y los astrocitos en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Las células deben mantenerse en triple cultivo durante seis días para inducir propiedades similares a las de BBB. El medio de cultivo celular debe cambiarse en ambos compartimentos de inserción de pocillos 24 horas antes de los experimentos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Transwell de 24 mm con inserto de membrana de poliéster de poro de 0,4 μm	Corning	3450
Platos con fondo de vidrio de 35 mm	MatTek Ciencias de la Vida (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Medio de astrocitos	Célula de Ciencia	Año 1801
Factor de apego	Sistemas celulares (Fisher Scientific)	4Z0-201
Completo Classic Medium con Serum y CultureBoost	4Z0-500	Sistemas de celdas
Tubos de centrífuga PP de 50 mL de Corning (fondo cónico con tapa CentriStar)	VWR	430829
Matraz de cultivo celular Corning de 75 cm² en forma de U con cuello inclinado sin tratar	Corning	431464U
Microplacas de poliestireno negro Corning CellBIND de 96 pocillos con fondo plano y transparente	Corning	3340
Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countes	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Contador de células automatizado	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Medio DMEM (sin glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol)	ThermoFisher	A14430-01	Medio sin glucosa
DPBS (sin calcio, sin magnesio)	ThermoFisher	14190250
Medio basal de crecimiento de células endoteliales EBM, sin rojo de fenol, 500 mL	Lonza	CC-3129
Incubadora de CO2
centrífuga