Un método para la bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos

Resumen

Fuente: de Melo, B. A. G., et al., Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejidos similares a las neuronas. J. Vis. Exp. (2021)

El video muestra el proceso de creación de una construcción bioimpresa en 3D utilizando astrocitos suspendidos en una solución de biotinta. La construcción bioimpresa, después de la reticulación, facilita la adhesión de los astrocitos y su propagación, formando tejido similar a un neural.

Protocolo

>1. Síntesis de gelatina de metacriloilo (GelMA)

1. Pesar 10 g de gelatina obtenida de la piel de cerdo y disolver en 100 mL de PBS dejando agitar la solución en una placa calefactora a 240 rpm y 50 °C hasta su completa disolución.
2. Bajo una campana, agregue 2 mL de anhídrido metacrílico (MA) para un bajo grado de funcionalización, y deje que la emulsión de gelatina se agite a 240 rpm y 50 °C durante 2 h.
   cautela: Indicación de peligro MA: H302 + H332 (dañino si se ingiere o inhala), H311 (tóxico en contacto con la piel), 314 (causa quemaduras graves en la piel y daño ocular), 315 (causa irritación de la piel), H317 (puede causar una reacción alérgica en la piel), H318 (causa daño ocular grave), 331 (tóxico si se inhala), H332 (dañino si se inhala), H335 (puede causar irritación respiratoria). Pautas de manejo: P261 (evitar respirar polvo/humo/gas/neblina/vapores/aerosoles), P305 + P351 + P338 + P310 (EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuague cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quítese los lentes de contacto, si los tiene y son fáciles de hacer. Continúe enjuagando. Llame inmediatamente a un CENTRO DE ENVENENAMIENTO/médico), P301 + P312 + P330 (SI SE REVUELCA: Llame a un CENTRO DE ENVENENAMIENTO/médico si se siente mal. Enjuague bucal).
   nota: Añadir MA muy lentamente, gota a gota.
3. Diluir la solución de gelatina-MA en 100 mL de PBS precalentado (50 °C) para obtener 200 mL de volumen final y dejar agitar la solución a 240 rpm y 50 °C durante 10 min.
4. Corte ~ 20 cm de membrana de diálisis (corte molecular 12-14 kDa) y sumérjala en agua desionizada hasta que esté blanda.
   nota: Llene las membranas con agua desionizada para asegurarse de que no haya agujeros ni defectos.
5. Con un embudo, transfiera la solución de gelatina-MA a las membranas.
   nota: Cierre ambos lados dejando espacio adicional en el interior para permitir la mezcla.
6. Colocar las membranas que contienen la solución de gelatina-MA en un recipiente con 2 L de agua destilada para diálisis y dejarlas agitar a 40 °C durante 5 días (500 rpm).
   nota: Cubra el recipiente para evitar la evaporación del agua.
7. Cambia el agua destilada dos veces al día. Cada vez, voltee las membranas al revés para homogeneizarlas.
8. Al quinto día, mezclar 200 mL de agua ultrapura precalentada (40 °C) con la gelatina-MA dializada y agitar durante 15 min a 40 °C.
9. Transfiera la solución de gelatina-MA a tubos cónicos de 50 mL hasta 25 mL y deje que los tubos permanezcan a -80 °C durante 2 días.
   nota: Almacene los tubos horizontalmente para facilitar la liofilización.
10. Liofilizar las soluciones congeladas durante 3-5 días y almacenar el GelMA liofilizado protegido de la humedad.

>2. Preparación de la biotinta

NOTA: Para obtener 1 mL de biotinta, se recomienda fabricar al menos 3 mL de solución de biomaterial, ya que puede haber pérdidas durante la filtración.

1. Preparación de la solución de fibrinógeno
   1. Preparar solución salina (NaCl 0,9%) en agua desionizada y disolver 10 mg de fibrinógeno de plasma bovino en 1 mL de la solución salina para obtener una concentración de 10 mg/mL.
      nota: Dado que el fibrinógeno se adsorbe en el vidrio, no utilice matraces de vidrio para preparar la solución de fibrinógeno.
   2. Dejar la solución agitada a 37 °C hasta la disolución completa del fibrinógeno.
      NOTA: Para la disolución del fibrinógeno, utilice un sistema rotativo colocado dentro de un horno a 37 °C. También es adecuada la agitación magnética (180 rpm) de fibrinógeno en una placa caliente a 37 °C. En esta condición, 10 mg/ml de fibrinógeno tardan aproximadamente 40 minutos en disolverse.
2. Preparación de la solución de gelatina/GelMA
   1. Pesar 0,12 g de gelatina y añadirla a 1,9 mL de PBS precalentado (40 °C) para obtener una concentración final de gelatina del 4% (p/v). Vórtice para facilitar la disolución.
   2. Mantener la emulsión a 40 °C hasta su completa disolución.
   3. Pesar 0,06 g de GelMA liofilizado y transferirlo a la solución de gelatina para obtener una concentración final de 2% (p/v) de GelMA. Vórtice para facilitar la disolución.
   4. Mantener la solución a 40 °C hasta la disolución completa.

>3. Preparación de biotinta de gelatina/GelMA/fibrinógeno cargada de astrocitos

1. Pipetear 0,9 mL de la solución de fibrinógeno de 10 mg/mL y transferir a la solución de gelatina/GelMA para obtener una concentración final de 3 mg/mL de fibrinógeno.
2. Pesar 0,015 g de fotoiniciador (PI) y transferir a la solución de gelatina/GelMA/fibrinógeno para obtener una concentración final de 0,5% (p/v) de PI. Mezcle la solución volteando el tubo hacia arriba y hacia abajo y manténgalo a 40 °C protegido de la luz para evitar la degradación del PI.
   nota: Almacene la biotinta a 4 °C durante un máximo de 24 h.
3. Bajo el flujo laminar, filtre la solución con un filtro de 0,2 μm en un tubo cónico estéril de 15 mL.
   nota: La solución de biomaterial debe estar a 37-40 °C para permitir la filtración.
4. Transfiera 980 μL de la solución de biomaterial a un tubo cónico de 15 mL.
5. Diluir laminina en solución salina para obtener una solución madre de 100 μg/mL.
6. Pipetear 20 μL de laminina y transferir al tubo que contiene la biotinta para obtener una concentración final de 2 μg/mL de laminina.
7. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, evitando burbujas. Si persisten las burbujas, centrifugar el tubo cónico a 200 x g durante 2 min. Mantenga la biotinta a 37 °C hasta que se mezcle con las células.
8. Tripsinar astrocitos primarios con tripsina al 0,05% durante 5 min.
   nota: Utilice los astrocitos de los pasajes 1 a 3.
9. Neutralizar la actividad de la tripsina con FBS en una proporción de 1:1 y transferir las células a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
10. Cuente las células y transfiera 1 x 106 células a un tubo cónico diferente. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
11. Retire el sobrenadante dejando un pequeño volumen (~200 μL) para suspender el pellet de celda, golpeando suavemente la parte inferior del tubo cónico.
12. Transfiera 1 mL de solución de gelatina/GelMA/fibrinógeno al tubo que contiene las células y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar, obteniendo una concentración final de 1 x 10⁶ células/mL.

>3. Preparación de la solución de reticulación

1. Reconstitución de la trombina
   1. Preparar una solución madre de trombina 100 U/mL en agua desionizada estéril con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% (p/v) en un tubo cónico de 15 mL. Stock en microtubos a -20 °C.
      NOTA: Dado que la trombina se adsorbe en el vidrio, no utilice matraces de vidrio para preparar la solución madre ni almacenar las alícuotas.
2. Preparación de la solución de trombina-CaCl₂
   1. Pipetear 100 μL de solución madre de trombina y transferir a un tubo cónico de 50 mL que contenga 8,9 mL de agua desionizada estéril para obtener una concentración final de 1 U/mL de trombina.
   2. Prepare una solución de CaCl₂ al 10% (p/v) en agua desionizada y esterilice con un filtro de 0,2 μm.
   3. Trasvasar 1,1 mL de la solución de CaCl₂ al 10% al tubo cónico que contiene trombina para obtener una relación final de 1:9 (CaCl₂ a trombina)
      nota: Prepare la solución de reticulación en el volumen para el experimento, evitando el almacenamiento.

>4. Bioimpresión de biotinta cargada de astrocitos utilizando una bioimpresora basada en extrusión

1. Diseño del tejido neural
   1. Usando el código G: construya una cuadrícula de 6 x 6 mm (forma cuadrada) con 1 mm de distancia entre cada línea bioimpresa en los ejes X e Y, y 6 capas en el eje Z (0,2 mm entre cada línea); ajuste la extrusión (E) a 0.01 mm, aumentando 0.001 mm en cada nueva capa del eje Z; y ajuste la velocidad de impresión (F) a 400 mm/min (Información complementaria).
2. Configuración de la bioimpresora
   1. Exponga la máquina a la luz ultravioleta durante 15 minutos y luego límpiela con etanol al 70%.
   2. Encienda la bioimpresora con el interruptor de encendido. Conecte la máquina a la computadora a través de un cable USB. Abra el software de control para conectarlo a la bioimpresora y cargue el diseño del archivo.
3. Preparación de la jeringa de bioimpresión
   1. Transfiera la biotinta de gelatina/GelMA/fibrinógeno cargada de astrocitos a una jeringa de plástico de 5 ml con una pipeta de 1.000 μL.
      nota: Transfiera lentamente para evitar la formación de burbujas.
   2. Conecte una aguja estéril sin filo de 22 g a la jeringa.
      nota: Deje la jeringa a 4 °C durante 2 min.
   3. Conecte la jeringa al cabezal de impresión de la bioimpresora y enjuague manualmente la biotinta para eliminar las burbujas restantes.
4. Bioimpresión
   NOTA: La bioimpresión se realizó fuera de la campana laminar.
   1. Coloque una placa de cultivo de 35 mm en la mesa de la bioimpresora y coloque la aguja a 0,1 mm de distancia de la superficie de la placa de cultivo para permitir el movimiento de la aguja.
      NOTA: Utilice una placa de cultivo de 35 mm para cada bioimpresión.
   2. Presione el botón Imprimir.
   3. Una vez finalizada la bioimpresión, asegúrese de que la jeringa se aleje de la placa. Luego, cierre el plato de cultivo y prepárese para el proceso de reticulación.
      nota: La bioimpresión de un constructo tarda aproximadamente 1 min y 10 s.
5. Entrecruzamiento entre el constructo bioimpreso y la cultura
   1. Coloque la placa de cultivo bajo luz ultravioleta a 2 mW/cm2 durante 2 x 60 s (arriba y abajo) para la reticulación de GelMA.
   2. Bajo el flujo laminar, transfiera la construcción bioimpresa a una placa de 24 pocillos con una espátula estéril.
   3. Añadir 500 μL de solución de trombina/CaCl₂ y dejar actuar durante 30 min para permitir la reticulación de la fibrina.
   4. Retire la solución de reticulación y lave la construcción con 2 mL de PBS 1x. A continuación, sustituya el PBS por 1 mL de medio de cultivo de astrocitos e incube a 37 °C y 5% de CO₂. Cambie el medio cada 3 días.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bioimpresora 3D	Soluciones de biotecnología 3D		Bioimpresora basada en extrusión
Pinzas de punta roma	Integra Miltex	6--30	Pinzas para disección cerebral previamente esterilizadas
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Sin proteasas, sin ácidos grasos, esencialmente sin globulina
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Matraz de cultivo celular	Fisher Científico	156340	matraz de cultivo T25
DAPI	Abcam	AB224589	Solución de tinción DAPI
DMEM/F12	Gibco; Corporación de Tecnologías de la Vida	12500062	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) con L-glutamina
Tubo de diálisis	Sigma-Aldrich	D9527	Peso molecular de corte = 14 kDa
etanol	Fisher Científico	64-15-5	Grado de reactivo
Suero Fetal Bovino	Gibco; Corporación de Tecnologías de la Vida	12657011	Grado de investigación
fibrinógeno	Sigma-Aldrich	9001-32-5	Polvo cristalino de fibrinógeno a partir de plasma bovino
gelatina	Sigma-Aldrich	9000-70-8	Gelatina en polvo de piel porcina
Solución salina tamponada de Hanks (HBSS)	Gibco; Corporación de Tecnologías de la Vida	14175095	Sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol
Laminina	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminina 1-2 mg/mL L en 50 mM Tris-HCl
Anhídrido metacrílico	Sigma-Aldrich	760-93-0	Para la preparación de GelMA
Aguja 22G	Fisher Científico	NC1362045	Aguja roma estéril
placa de Petri	Corning Incorporado	430591, 430588	Placas de Petri estériles de 35 y 100 mm
Fotoiniciador	Sigma-Aldrich	106797-53-9	2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona
Tampón de fosfato salino (PBS)	Gibco; Corporación de Tecnologías de la Vida	10010023	PBS 1 x, grado de cultivo, sin calcio, sin magnesio
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Hidrobromuro de poli-L-lisina mol wt 30.000-70.000
Jeringa 5 mL	Bd	1222C84	Jeringa estéril
Filtro de jeringa 2 μm	Fisher Científico	09-740-105	Filtro de polipropileno para esterilización
trombina	Sigma-Aldrich	9002--04-4	Trombina polvo cristalino de plasma bovino
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Grado de laboratorio
Tripsina-EDTA	Gibco; Corporación de Tecnologías de la Vida	15400054	Rojo de tripsina sin fenol 1 x diluido en PBS
Placa de pozo	Termo Científico	144530	Placa estéril de 24 pocillos