Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Tiolación del ácido hialurónico
NOTA: Las relaciones molares se indican con respecto a un número total de grupos carboxilato a menos que se especifique lo contrario.
- Disolver 500 mg de hialuronato de sodio (HA, 500-750 kDa) a 10 mg/mL en agua destilada desionizada (DiH2O) en un matraz Erlenmeyer esterilizado en autoclave de 250 mL. Agite la solución (~ 200 rpm) a temperatura ambiente durante 2 horas para disolver completamente el HA. Utilice una barra de agitación y una placa de agitación magnética para mantener la reacción agitada durante el procedimiento de tiolación.
- Usando ácido clorhídrico (HCl) 0,1 M, ajuste el pH de la solución de HA a 5,5. Pesa 69,6 mg (proporción molar de 0,25x) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC).
nota: Aunque el EDC no disuelto se puede agregar directamente a la solución de AH, generalmente es más fácil disolver el EDC primero en 1 mL de DiH2O y luego agregar rápidamente la solución de EDC a la solución de HA. La predisolución en 1 mL de DiH2O también se puede realizar con N-hidroxisuccinimida (NHS) y cistamina dihidrocloruro antes de añadir a la reacción en los pasos 1.3 y 1.4.
- Agregue 17,9 mg (proporción molar de 0,125x) de NHS a la reacción. Ajuste el pH de la solución de reacción a 5,5 utilizando 0,1 M de HCl e incube la reacción a temperatura ambiente durante 45 minutos.
- Agregue 70,0 mg (proporción molar de 0,25x) de diclorhidrato de cistamina a la solución de reacción. Utilice hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 M para ajustar el pH a 6,25. Incube la reacción a temperatura ambiente durante la noche mientras revuelve.
- Al día siguiente, use 1 M de NaOH para ajustar el pH de la solución de reacción a alrededor de 8. Agregue 192 mg (proporción molar 4x) de ditiotreitol (DTT) a la reacción. Ajuste el pH a 8 después de la adición de DTT y deje remover durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
- Use 1 M de HCl para ajustar el pH a 4. Transfiera toda la mezcla de reacción a una membrana de diálisis previamente empapada (corte de peso molecular alrededor de 13 kDa) y dialice contra DiH2O preajustado a pH 4.
nota: El volumen de DiH2O para diálisis debe ser al menos 40 veces el volumen de la solución de HA reaccionada (p. ej., 50 mL de muestra en 2 L de DiH2O, pH 4).
- Reemplace la solución de diálisis (DiH2O, pH 4) dos veces al día durante 3 días a temperatura ambiente.
- Filtre la solución dializada a través de un filtro de membrana de 0,22 μm accionado por vacío. Solución de congelación instantánea de HA tiolado en nitrógeno líquido. Utilice un liofilizador para congelar muestras secas durante 2 días. El AH tiolado en forma seca puede almacenarse en un desecador sellado al vacío a -20 °C durante al menos 6 meses.
- Para determinar el grado de tiolación, utilice la prueba de Ellman y/o la espectroscopia de RMN de protones><.
>2. Preparación de materiales de reticulación
- Disuelva el AH tiolado a la concentración deseada (en este ejemplo, 13,3 mg/mL) en solución salina tamponada con HEPES (20 mM HEPES en el tampón de solución salina equilibrada (HBSS) de Hank, ajustado para que caiga dentro de un pH de 8-9) en un vial de color ámbar para minimizar la exposición a la luz ambiental. Mantenga la solución revolviendo constantemente.
nota: La formación de enlaces disulfuro entre tioles conjugados con HA puede ocurrir si el pH está por encima de 8, la concentración de la solución es demasiado alta o la solución se deja agitar durante demasiado tiempo antes de la gelificación. Para evitar este problema, use menos de 15 mg / mL de HA tiolado y disuelva el HA tiolado dentro de las 2 horas posteriores a la formación de hidrogeles.
- Disuelva la maleimida PEG de 4 brazos (PEG-Mal, 20 kDa) y el tiol PEG de 4 brazos (PEG-tiol, 20 kDa) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, para preparar soluciones madre de 50 mg/mL de PEG-Mal y PEG-tiol.
nota: Se tarda al menos 1 hora en disolver completamente los reactivos de PEG.
- Si agrega péptidos derivados de ECM, disuelva los péptidos que contienen cisteína en PBS para preparar una solución madre.
nota: Utilice una concentración de material de 2-4 mM.
- Remoje los moldes de caucho de silicona en etanol durante al menos 20 minutos para limpiarlos y luego autoclave para su esterilización.
>3. Reticulación de hidrogel y encapsulación celular
>NOTA: A modo de ejemplo, se describe la encapsulación de cuatro hidrogeles individuales de 80 μL con 0,5% (p/v) de HA y un módulo de compresión de 1 kPa3. Consulte la Tabla 1, por ejemplo, recetas que producen hidrogeles con diferentes propiedades: dos hidrogeles que incorporan el péptido de unión a integrina RGD y dos hidrogeles que incorporan tapas de cisteína como control negativo de la actividad peptídica. La concentración de siembra de células GBM derivadas del paciente es de 500.000 células/mL.
- Diluir la solución madre de PEG-Mal (50 mg/mL, del paso 2.2) a 12,5 mg/mL añadiendo 40 μL de la solución madre a 120 μL de PBS. Divida la solución diluida en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, cada uno con 80 μL.
- Añadir 16 μL de solución madre de RGD (2,8 mM, a partir del paso 2.3) a un tubo y 16 μL de solución madre de cisteína (2,8 mM, a partir del paso 2.3) al segundo tubo. Vórtice para mezclar. Coloque las soluciones PEG-Mal-RGD o PEG-Mal-CYS en hielo hasta su uso en el paso 3.9.
nota: El procedimiento descrito aquí produce hidrogeles con ~140 μM de péptido. Esto equivale a que aproximadamente 1 de cada 8 brazos PEG disponibles estén ocupados por un péptido. Esto se puede variar alterando la proporción molar de los péptidos terminados en cisteína a los grupos maleimida disponibles. En general, se puede lograr una concentración máxima de 280 μM de péptido mientras se deja un número suficiente de grupos maleimida disponibles para la reticulación de hidrogeles.
- Diluir la solución madre de PEG-tiol (50 mg/mL, del paso 2.2) a 5 mg/mL mezclando 4 μL de solución madre de 50 mg/mL con 36 μL de PBS. Añadir 120 μL de AH tiolado disuelto del paso 2.1 a la mezcla.
nota: Las soluciones de HMW HA son muy viscosas. Por lo tanto, recomendamos utilizar una punta de micropipeta de orificio ancho para transferir las soluciones. Pipetee lentamente para evitar que la solución se adhiera a las paredes de la punta de la micropipeta y para mejorar la precisión de la medición.
- Coloque los moldes limpios y secos (preparados en el paso 2.4) en cada pocillo de una placa de 12 pocillos tratada con cultivo de tejidos. Con el extremo limpio y romo de la punta de una pipeta, presione el molde de gel y vuelva a verificar el sellado entre los moldes y la parte inferior de la placa del pocillo.
nota: Vuelva a comprobar el sello justo antes de la encapsulación para evitar fugas.
- Pasaje de células GBM cultivadas, disociadas a células individuales y determinando la concentración celular como se describió anteriormente3.
nota: Algunas líneas GBM no se pueden disociar en celdas individuales. En este caso, se pueden encapsular gliomasferas completas. Sin embargo, prepare las células individuales disociadas después de un recuento preciso de células para mejorar la reproducibilidad. El protocolo para el paso del gliomasfera varía entre los diferentes laboratorios, y es probable que muchos de ellos sean compatibles con la encapsulación de hidrogel.
- (Recomendado) Centrifugar gliomasferas a 500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y agregue 1 mL de enzima de disociación celular al pellet celular. Luego, incuba durante 5 minutos, golpeando suavemente el tubo para agitar.
- Añadir 4 mL de medio de cultivo completo (50 ng/mL de EGF, 20 ng/mL de FGF-2, 25 μg/mL de heparina, suplemento de G21 y 1% de penicilina/estreptomicina en DMEM/F12) a las células.
- Centrifugar de nuevo a 500 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Finalmente, vuelva a suspender el pellet de celdas en 1 mL del medio completo y pase las celdas suspendidas a través de un filtro de celdas de 70 μm. (Recomendado) lavar el colador con 4 mL adicionales del medio completo para maximizar el número de células recuperadas.
- Estimar la concentración de células en la suspensión utilizando un hemocitómetro. Divida la suspensión de la celda en 2 tubos de centrífuga, donde cada tubo contiene ~ 80,000 celdas. Centrifugar a 500 x g durante 5 min; generalmente, 80.000 células formarán 2 hidrogeles de 80 μL.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender un pellet en 80 μL de solución de PEG-MAL-RGD y un segundo pellet en 80 μL de solución de PEG-MAL-CYS (preparado en el paso 3.1).
- Con una punta de micropipeta de orificio ancho de 200 μL, dispense 40 μL de solución de AH (del paso 3.3 anterior) en cada molde de caucho y silicona (como se preparó en el paso 3.4).
- Con una punta de micropipeta de orificio ancho de 200 μL, mezcle los 40 μL de solución celular PEG-MAL-CYS o PEG-MAL-RGD con la solución de AH en el molde. Pipetea hacia arriba y hacia abajo rápidamente no más de 10 veces. Repita para cada cultivo en gel que se esté preparando.
nota: Este paso requiere práctica, ya que la gelificación inicial se produce rápidamente (dentro de los 30 s). Pipetea hacia arriba y hacia abajo mientras mueves la punta a diferentes lugares en los moldes para asegurar una mezcla uniforme. Mantenga siempre la punta por debajo del nivel del líquido para evitar la formación de burbujas de aire. No mezcle la solución demasiadas veces, ya que puede formarse gel dentro de la punta de la micropipeta. PEG-MAL-CYS y PEG-MAL-RGD pueden combinarse en diferentes proporciones para lograr la concentración deseada de péptidos RGD.
- Coloque la placa de pocillo que contiene células encapsuladas en gel en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 5-10 minutos para asegurar la finalización de la reacción.
- Agregue 2-2.5 mL de medio de cultivo a cada pocillo con geles formados. Utilice una punta de pipeta estéril de 2 μL o una microespátula para separar suavemente el molde y el gel. Utilice pinzas preesterilizadas para eliminar el molde de la placa del pocillo. Vuelva a colocar la placa de pocillos en la incubadora de celdas (37 °C y 5% de CO2) para el cultivo y futuros experimentos.
nota: Tire del molde verticalmente hacia arriba para evitar dañar los cultivos en gel. En general, el medio en los cultivos en gel debe reemplazarse cada 3-4 días. Tenga cuidado de no aspirar hidrogeles al retirar el medio. Si esto es un problema, recomendamos utilizar una pipeta de transferencia de plástico. Si se planea la obtención de imágenes de bioluminiscencia para rastrear el número de células, las células GBM deben transducirse con lentivirus que codifica constitutivamente la expresión de luciferasa antes de la encapsulación, como se describió anteriormente3. Para las imágenes de bioluminiscencia, agregue 1 mM de D-luciferina al medio de cultivo 1 h antes de la imagen de luminiscencia.
