1. Preparación previa a los cultivos organotípicos de cortes cerebelosos
- En una campana de cultivo celular rociada previamente con etanol al 70%, prepare 200 mL de medio de cultivo en un filtro de vacío de 250 mL con tapa de botella conectado a un receptor de botella estéril. Agregue 100 mL de Medio Basal Eagle (BME), 50 mL de Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS), 50 mL de suero de caballo inactivado por calor, 1 mL de L-Glutamina 200 mM (concentración final 1 mM) y 5 mL de glucosa de 200 g/L (concentración final 5 mg/mL). Filtre al vacío el medio de cultivo y manténgalo a +4 °C durante un mes.
- En el gabinete de bioseguridad esterilizado, saque una placa de cultivo de 6 pocillos de su paquete. Llene cada pocillo con 1 mL de medio de cultivo. Si se prueba un tratamiento, agregue el agente farmacológico al pocillo tratado y el mismo volumen de solución vehículo para el pocillo de control. En el presente estudio, añadimos 1 μL de solución estéril de KCl 3 M al pocillo tratado (30 mM final) y 1 μL de agua estéril a los pocillos control.
- Introduzca en la campana de cultivo celular el número necesario de insertos de cultivo celular envueltos individualmente con membrana hidrofílica de politetrafluoroetileno (PTFE) (tamaño de poro = 0,4 μm). Desenvuélvalos con cuidado y extraiga los insertos de cultivo celular con pinzas estériles. Déjelos caer uno por uno en un pocillo de una placa de 6 pocillos, evitando burbujas en la interfaz entre la membrana del inserto y el medio de cultivo celular. Deje que los insertos se equilibren en el medio en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante al menos 2 h antes del cultivo.
nota: El picador de tejidos reside permanentemente en la campana de cultivo celular.
- Prepare dos vasos de precipitados de 200 mL, uno lleno de 150 mL de agua estéril y el otro lleno de 150 mL de etanol al 70%. Sumerja las herramientas quirúrgicas en el baño de etanol al 70% y luego en agua antes de usarlas.
nota: No utilice instrumentos quirúrgicos inmediatamente después del contacto con el etanol.
- Desinfecte la cuchilla de doble filo en el vaso de precipitados de etanol al 70%. Colóquelo en el soporte de la hoja con pinzas estériles y manténgalo en su lugar con la llave de abrazadera de la hoja. Déjalo secar hasta que lo uses.
- Desinfecte el disco de plástico provisto con el picador de pañuelos en el vaso de precipitados de etanol al 70%. Rocíe la mesa de corte con etanol al 70% antes de colocar el disco sobre ella. Deje secar hasta su uso.
>2. Disección y cultivos de corte organotípico cerebeloso
- Lleve a la cría de ratón dentro de la campana de cultivo celular para realizar la disección.
- Decapita al cachorro rápidamente con unas tijeras rectas (Figura 1A).
- Mientras sostienes la cabeza del cachorro por la nariz con pinzas de vendaje rectas, corta el cuero cabelludo con unas tijeras de ojo recto, comenzando desde el extremo posterior y yendo lateral hasta la línea media.
- Proceda de manera idéntica para el cráneo.
nota: Asegúrate de apuntar las puntas de las tijeras hacia afuera para evitar dañar el cerebelo durante la disección.
- Extraiga el cerebro y transfiéralo a un plato de 60 mm lleno de HBSS frío + 5 mg/ml de glucosa.
- Diseccionar cuidadosamente el cerebelo con pinzas finas rectas estériles (Figura 1B). Transfiéralo al disco de plástico colocado en la mesa de corte de la picadora de pañuelos con pinzas finas curvas estériles.
- Orientar el tejido girando la mesa de corte para realizar cortes parasagitales.
- Mueva la mesa de corte tirando de la perilla de liberación de la mesa hacia la derecha, de modo que la cuchilla quede colocada en el borde del pañuelo.
- Ajuste el grosor de la rebanada a 350 μm y la velocidad de la cuchilla a media.
- Encienda el picador. Una vez que se haya cortado todo el cerebelo (Figura 1C), apague la picadora.
- Retire el disco de plástico con pinzas estériles.
- Acerque con cuidado el disco de plástico a un plato de 60 mm que contenga HBSS + 5 mg/ml de glucosa. Pipetear HBSS frío + 5 mg/mL de glucosa en el tejido utilizando una pipeta de transferencia estéril para permitir la recolección de rodajas cerebelosas en el plato lleno de tampón.
- Separe las rodajas cerebelosas entre sí con una microsonda. Extraiga secciones de buena calidad con la pipeta de transferencia (se recomienda utilizar secciones de tejido que estén cerca de los vermis) y colóquelas en un inserto de cultivo celular preequilibrado (Figura 1D).
- Coloque las rodajas cerebelosas en el inserto de cultivo celular con la microsonda, luego retire con cuidado el exceso de HBSS + 5 mg/ml de solución de glucosa con la pipeta de transferencia.
nota: En esta etapa, el tejido es extremadamente sensible y propenso al daño físico. El número máximo de cortes cerebelosos por inserto de cultivo celular depende de la edad del animal donante. Se pueden cultivar de 6 a 8 rodajas para un animal de P0 a P4, y de 4 a 6 rodajas para animales de más de P5.
- Coloque la placa de cultivo en la incubadora, cambiando el medio por completo cada 2 o 3 días.
- Para evaluar la supervivencia de las células de Purkinje, se pueden recolectar cortes a partir de 5 días in vitro. Para otros fines, pueden mantenerse en cultivo durante varias semanas (Figura 1F).
nota: En el caso de los experimentos de supervivencia celular de Purkinje, no es necesario renovar el tratamiento farmacológico al cambiar el medio de cultivo celular (Figura 1F).
3. Inmunofluorescencia
- Saque la placa de 6 pocillos de la incubadora. Retire el medio de cultivo celular, lave el inserto de cultivo celular con 1x PBS y fije las rodajas con una solución fría de paraformaldehído al 4% durante 1 h, con 1 mL debajo del inserto de cultivo celular y 500 μL encima del inserto de cultivo celular.
- Lave los insertos 4 veces 10 min con 1 PBS, con 1 mL debajo y 500 μL encima del inserto, en un agitador orbital.
- Con un cepillo, transfiera las rodajas cerebelosas de 1 inserto de cultivo celular a 1 pocillo de un prellenado de 24 pocillos con 1x PBS, 0,25% Triton X-100 y 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/pocillo.
- Permeabilizar y bloquear las lonchas mediante incubación en PBS-TB durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar con anticuerpos primarios diluidos en la solución de PBS-TB, durante la noche a + 4 °C, en un agitador orbital, 200 μL/pocillo.
- Al día siguiente, realizar cuatro lavados de 10 min con 1x PBS, en un agitador orbital, 500 μL/pocillo.
- Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en la solución de PBS-TB, dos horas a temperatura ambiente, en un agitador orbital y protegido de la luz, 200 μL/pocillo.
- Realizar cuatro lavados de 10 min con 1x PBS, en un agitador orbital, 500 μL/pocillo.
- Contratinción de las lonchas con Hoechst 33342, diluido en 1x PBS (2 μg/mL), durante 10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz, 500 μL/pocillo.
- Monte los cortes cerebelosos en un portaobjetos de microscopía con una pipeta de transferencia. Deja que se sequen completamente al aire, protegidos de la luz. Vuelva a humedecerlos con 1x PBS y aplique un cubreobjetos cubierto con unas gotas de medio de montaje (~80 μL). Evita hacer burbujas.
- Una vez que el medio de montaje se ha curado, las secciones cerebelosas están listas para ser fotografiadas.
>4. Imagen y cuantificación de la supervivencia celular
- Encienda el microscopio y los láseres según el fabricante.
- Inicie el software de adquisición.
- Usando un objetivo 10X, localice cortes cerebelosos no alterados que presenten de 9 a 10 lóbulos (generalmente secciones cerebelosas cerca del vermis).
- Activar la adquisición de z-stack. Defina el rango de la pila z para incluir todas las células de Purkinje presentes en la porción cerebelosa. Establezca un tamaño de paso de 2 μm e inicie la adquisición. Guarde la imagen adquirida en el formato del fabricante del software de adquisición para conservar los metadatos asociados.
- Abra el archivo adquirido en ImageJ usando el complemento Bio-formats.
- Vaya a la imagen > pilas > proyecto Z... (Figura 2A).
- Elija Intensidad máxima en el menú desplegable Tipo de proyección y haga clic en Aceptar (Figura 2B).
- Se generará una imagen 2D aplanada. Haga doble clic en la herramienta Multipunto para que aparezca la ventana de la herramienta Punto. Desmarque la opción Etiquetar puntos para facilitar la visualización de las celdas contadas. Luego, haga clic directamente en un soma de una celda de Purkinje para comenzar a contar (Figura 1E). El número total de celdas contadas se indicará en la parte inferior de la ventana de la herramienta Punto (Figura 3).
nota: Por lo general, se pueden cuantificar al menos 3 secciones no dañadas que contienen 9-10 lóbulos por inserto de cultivo celular. Para evaluar el efecto neuroprotector de un agente farmacológico, se deben realizar al menos 3 experimentos independientes.
