Disociación y cultivo de neuronas a partir de muestras de tejido del hipocampo

Resumen

Fuente: Servello, D. et al., Un sistema microbiomecánico para estudiar la formación y recuperación de varicosidades en los axones de las neuronas centrales. J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra la disociación y el cultivo de neuronas del hipocampo a partir de muestras de tejido del hipocampo utilizando disociaciones enzimáticas y mecánicas. El tratamiento con Ara-C inhibe el crecimiento de células no neuronales, facilitando el crecimiento selectivo de las neuronas del hipocampo.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

>1. Disección, disociación y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones/ratas embarazadas

1. Disección y disociación de neuronas del hipocampo para cultivo
   1. Descongele la solución de enzima proteasa (3 mg/mL de proteasa 23 en la solución de disección Slice, SLDS, Tabla 1) y los medios de recubrimiento precalentados (Tabla 2) a 37 °C.
   2. Diseccionar el hipocampo y enjuagar con SLDS.
      nota: Cuatro hipocampos proporcionan suficientes células para una placa de 24 pocillos o una placa de 6 pocillos.
   3. Retirar SLDS, añadir 2 mL de solución de enzima proteasa e incubar la muestra a 37 °C, 5% CO₂, durante 15 min.
   4. Lave los explantes del hipocampo con 5-10 mL de medio de siembra dos veces. Agregue 5 mL de medio de recubrimiento. Disociar los explantes del hipocampo en células individuales generando un pequeño vórtice utilizando una pipeta con una punta de plástico de 1 mL. Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas 40 veces, evitando la formación de burbujas de oxígeno, hasta que la solución se vuelva turbia y no queden trozos grandes de explante.
      nota: Recuerde dejar algunos medios durante los lavados, los explantes del hipocampo deben permanecer sumergidos en el medio durante todo el proceso.
   5. Centrifugar las células a 1.125 x g durante 3 min. Retirar el sobrenadante con las células sumergidas en el medio. Vuelva a suspender las células en 145 mL de medio de recubrimiento. Agregue 1 mL/pocillo de la suspensión celular a una placa de 24 pocillos (3 mL/pocillo a una placa de 6 pocillos).
      NOTA: Se utilizan 145 mL de medio de recubrimiento para producir una suspensión celular que tiene una baja densidad celular. Este volumen permitirá la siembra de células en seis placas de 24 pocillos, ocho placas de 6 pocillos o varias combinaciones de placas de 24 o 6 pocillos, dependiendo de los experimentos que se vayan a realizar. Cada pocillo de la placa de 24 pocillos tendrá aproximadamente 3 x 10⁴ celdas.
   6. Incubar las células en el medio de recubrimiento a 37 °C, 5% de CO₂ durante 2-4 h, luego retire todos los medios de recubrimiento y reemplácelos con medios de mantenimiento nuevos.
   7. Después de 2 días (2 días in vitro, 2DIV), reemplace la mitad del medio con 2 μM de Ara-C (arabinosilcitosina) disuelto en el medio de mantenimiento, lo que inhibe el crecimiento de fibroblastos, células endoteliales y gliales. Después de exponer las células a Ara-C durante dos días, reemplace el medio con medios de mantenimiento nuevos.

Tabla 1: Solución de recubrimiento de cubreobjetos. Proporciona la receta para preparar la solución de recubrimiento de cubreobjetos utilizada para adherir las células cultivadas a los cubreobjetos.

Solución de recubrimiento de cubreobjetos
780 μL	Ácido acético17 mM stock: 50 μL de ácido acético en 50 mL de H2O
200 μL	Poli-D-lisina (0,5 mg/mL de stock)
20 μL	Colágeno cola de rata (3 mg/mL de caldo)
El volumen total se determina en función del número de cubreobjetos a recubrir.

Tabla 2: Recetas de medios de cultivo celular. Proporciona las recetas para preparar medios utilizados en el cultivo de células primarias de neuronas del hipocampo.

1x Solución de disección en cortes (SLDS), filtrada, pH= 7,4, almacenar a 4 °C
1 L	ddH2O
82 mM	Na2SO4
30 mM	K2SO4
10 mM	HEPES (ácido libre)
10 mM	D-glucosa
5 mM	MgCl2
0.00%	Rojo de fenol (opcional)
Medios de recubrimiento (PM, filtro, almacenamiento a 4 °C)
439 mL	Sales de MEM Earle
50 mL	FBS
11.25 mL	20% de D-glucosa
5 mL	Piruvato de sodio (100 mM)
62,5 μL	L-glutamina (200 mM)
5 mL	Penicilina/estreptomicina (P/S, 100x)
Medios de mantenimiento (MM, filtro, almacenamiento a 4 °C)
484 mL	Neurobasal
10 mL	Suplemento B27 50x
1.25 mL	L-glutamina (200 mM)
5 mL	100x P/S
Todas las soluciones se esterilizan utilizando un filtro con un tamaño de poro de 0,2 mm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos de 12 mm	Instrumentos Warner	64-0702	Para placa de 24 pocillos
Cubreobjetos de 25 mm	Fisher Científico	Teléfono 12-545-102	Para placa de 6 pocillos
ácido acético	Fisher Científico	A38-212
Poli-D-lisina	sigma	P6407
Colágeno de cola de rata	Roche	11 179 179 001
10 veces PBS	Diagnóstico Nacional	CL-253
Na2SO4	Fisher Científico	S373-500
K2SO4	Fisher Científico	P304-500
HEPES	Fisher Científico	BP410-500
D-glucosa	Fisher Científico	D16-500
MgCl2	Fisher Científico	BP214-500
NaOH	Fisher Científico	SS255-1
Enzima proteasa	sigma	P4032
FBS	Gibco	26140
Piruvato de sodio	Gibco	11360-070
L-glutamina	Gibco	25030081
Penicilina/Estreptomicina 100x (P/S)	Gibco	15140122
Sales de MEM Earle	Gibco	11090
Suplemento de B27	Gibco	17504-044
Neurobasal	Gibco	21103-049
Arabinosilcitosina (Ara-C)	sigma	147-94-4
Medios Opti-MEM	Gibco	31985-070