Diferenciación de células madre embrionarias humanas en oligodendrocitos

Resumen

Fuente: Assetta, B., et al. Generación de neuronas humanas y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes para modelar las interacciones neurona-oligodendrocitos. J. Vis. Exp (2020).

Este video demuestra el proceso de generación de células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) a partir de células madre embrionarias humanas, seguido de la maduración de OPCs a oligodendrocitos. Este proceso de generación de oligodendrocitos abre numerosas vías para mejorar la investigación y el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, incluido el Alzheimer.

Protocolo

1. Inducción de células precursoras de oligodendrocitos humanos (OPC) a partir de células madre pluripotentes y maduración de oligodendrocitos

1. Generación de células progenitoras neuronales (NPC): protocolo monocapa (~7 días). Consulte la Figura 1A para ver el diagrama de flujo.
   1. Utilice células madre embrionarias humanas H1 disponibles comercialmente en el paso de 52 (véase la Tabla de Materiales). Cultive las células en placas de 6 pocillos recubiertas de solución de matriz extracelular (~0,5 mg de solución de matriz por placa de 6 pocillos; ver Tabla de Materiales) utilizando medio de mantenimiento de células ES (ver Tabla de Materiales) e incubar las placas a 37 °C con 5% de CO₂.
   2. Transdiferenciar las células en células progenitoras neurales (NPC) mediante un enfoque establecido llamado SMADi dual, con inhibidores de moléculas pequeñas para múltiples vías de señalización. Aquí utilizamos un kit comercial ampliamente aceptado y seguimos el protocolo monocapa proporcionado por el fabricante (ver Tabla de Materiales).
   3. En el día -1, placa 0,5–1 x 10⁶ células por pocillo en una placa de 6 pocillos recubierta por una solución de matriz reducida en factor de crecimiento (ver Tabla de Materiales; ~0,5 mg de solución de matriz por placa de 6 pocillos) con medio de mantenimiento de células madre embrionarias (ES) (ver Tabla de Materiales). Esta solución de matriz reducida con factor de crecimiento se utiliza para recubrir todas las placas que se utilizarán en los siguientes pasos.
   4. En el día 0, trate las células durante 24 h con un medio de mantenimiento de células madre embrionarias (ver Tabla de materiales) suplementado con dimetilsulfóxido (DMSO) al 2%.
   5. Del día 1 al 6, cambie el medio completo por un medio de inducción neural tibio (37 °C) que contenga los inhibidores de SMAD del kit comercial (consulte la tabla de materiales). Si las células se dividen y alcanzan la confluencia antes del día 7, páselas a la densidad de siembra de 0,5-1 x 10⁶, como se describió anteriormente en el paso 1.1.3.
   6. En el día 7, pase los NPC usando solución de desprendimiento de celdas (ver Tabla de Materiales) y placa a una densidad de siembra de 1-2 x 10⁵ celdas/pocillo de una placa de 24 pocillos.
   7. Eficiencia de la diferenciación del ensayo mediante tinción inmunohistoquímica (IHQ) para la ausencia de marcadores de pluripotencia, como OCT4, y la presencia de marcadores NPC, como PAX6, Nestin y Sox1.
   8. En esta etapa, los NPC desprendidos se pueden congelar en los medios de congelación comerciales especializados en NPC (ver Tabla de Materiales) y almacenarse en nitrógeno líquido hasta por 3 meses. Después de congelarse y descongelarse por una vez, los NPC aún conservan la multipotencia para dar lugar a neuronas, astrocitos y OPC con protocolos confiables.
2. Generación de células precursoras de oligodendrocitos (OPC) (~7 días). Consulte la Figura 1A para ver el diagrama de flujo.
   1. En el día 7, pase las NPC usando una solución de desprendimiento de células (ver Tabla de Materiales) y póngalas a una densidad de siembra de 1-2 x 10⁵ celdas por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio de inducción neural caliente (37 °C) más inhibidores de SMAD del kit comercial (ver Tabla de Materiales).
   2. El día 8, prepare una solución de DMSO al 1% en el medio de diferenciación OPC y trate los NPC plateados durante 24 h. El medio de diferenciación OPC está compuesto por: medio basal (DMEM/F12), suplemento de N2 al 1%, suplemento de B27 al 1%, factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) a 20 ng/mL, agonista suavizado (SAG) a 1 μM, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA) a 10 ng/mL (ver Tabla de Materiales).
   3. En el día 9, reemplace el medio con un medio de diferenciación OPC nuevo sin DMSO. Alimente las células cada dos días hasta el día 15. Si las celdas alcanzan la confluencia antes del día 15, páselas a la densidad de siembra de 1-2 x 10⁵ celdas por pocillo, como se describe en el paso 1.2.1.
   4. En el día 14, placa OPC en medio de diferenciación OPC a una densidad de 1–2 x 10⁵ células/pocillo en una placa de 24 pocillos.
   5. En esta etapa (día 15), las células analizan la presencia de marcadores específicos de OPC mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) o reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) (p. ej., O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Figura 1B) y por la ausencia de marcadores NPC (Pax6 o Nestin; Figura 1D). Por lo general, detectamos la inmunorreactividad de O4 en más del 95% de las células el día 15. De particular relevancia para la enfermedad de Alzheimer, la expresión de APP (proteína precursora de amiloide), BACE1 (la proteasa de procesamiento β-secretasa 1) y el péptido amiloide-β (Aβ) son abundantes en las OPC (Figura 1F).
3. Maduración de oligodendrocitos (OL) (~7–20 días)
   1. En el día 15, reemplace el medio con un medio de maduración OL: medio Neurobasal-A, suplemento de B27 al 2%, 1 μM de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), 200 ng/mL de triyodotironina T3 y clemastina de 1 μM (ver Tabla de Materiales). Cambie el medio cada dos días o todos los días, si es necesario.
   2. Cuando las células alcanzan el 90% de confluencia, se dividen en una proporción de 1:3 hasta 2 pasos o hasta que la división celular se ralentice sustancialmente. Si las OPC se dividen demasiado rápido y alcanzan la confluencia en menos de 3 días, agregue Ara-C (consulte la Tabla de materiales) a una concentración de 2 a 5 μM durante 1 a 3 días. La proliferación activa indica una disminución de la eficiencia de maduración.
   3. Examinar la eficiencia de la maduración oligodendroglial mediante la evaluación de la expresión de marcadores OL, por ejemplo, CLDN11, PLP1, MBP por qPCR, tinción IHQ o inmunotransferencia. La morfología característica de estructuras altamente complejas (Figura 1C) y la expresión de marcadores OL (Figura 1E) deberían detectarse fácilmente para el día 28.

Resultados

Figura 1: Generación de iOPC (célula precursora de oligodendrocitos inducida) y maduración de iOL (oligodendrocitos inducidos). (A) Diagrama de flujo de generación de iOPC e iOL. (B) Imágenes representativas de campo claro e inmunofluorescencia de iOPC en el día 15. Olig2 (marcador pan-oligodendroglia) se muestra en verde, O4 (marcador OPC) en rojo y DAPI en azul. La...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Accutase	Tecnologías STEMCELL	7920
Suplemento de B27	ThermoFisher	17504044
bFGF	ThermoFisher	PHG 0266
campamento	MilliporeSigma	A9501
Clemastina	MilliporeSigma	SML0445
DMEM/F12 medio	Tecnologías STEMCELL	36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
Suero Fetal Bovino	ScienCell	10
Células madre embrionarias humanas H1	WiCell (Célula Inalámbrica	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Tecnologías STEMCELL	5825
Suplemento de N2	ThermoFisher	17502001
Medio neurobasal A	ThermoFisher	10888-022
Aminoácidos no esenciales	ThermoFisher	11140-050
PDGF-AA	Sistemas de investigación y desarrollo	221-AA-010
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
Polibreno	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
Inhibidor de ROCK Y-27632	Tecnologías STEMCELL	72302
Sag	Tocris	4366
STEMdiff Progenitor Neural Medios de Congelación	Tecnologías STEMCELL	5838
Kit de inducción neuronal STEMdiff SMADi	Tecnologías STEMCELL	8581
Triyodotironina T3	MilliporeSigma	T6397
Tempo-iOlogo: OPC derivadas de iPSC humanas	Tempo BioScience	SKU102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	52047
VSV-G	Addgene	12259