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1. Inducción de neuronas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas
- Preparación de lentivirus (~5 días)
- Placa ~ 1 millón de células de riñón embrionario humano 293T (HEK293T) cada matraz T75, para tenerlas ~ 40% confluentes al realizar la transfección. Transfectarlos con plásmidos que expresen neurogenina 2 (Ngn2) inducible por tetraciclina y gen resistente a puromicina (PuroR; bajo el mismo control de promotor de operador Tet (TetO), transactivador de tetraciclina inversa (rtTA) y los tres plásmidos auxiliares pRSV-REV, pMDLg/pRRE y VSV-G (12 μg de ADN vectorial lentiviral y 6 μg de cada uno de los ADN del plásmido auxiliar). Prepare al menos tres frascos por preparación de lentivirus. Use polietilenimina (PEI) para la transfección siguiendo las instrucciones del fabricante. Cambie el medio después de 16 h y deséchelo.
- Coseche las partículas virales liberadas recolectando medios de cultivo todos los días y reemplácelos con medios frescos durante 3 días. Agrupe los medios recolectados que contienen partículas virales para su purificación. Filtrar el virus a través de un filtro de 0,22 μm y centrifugar a 49.000 x g durante 90 min. Vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de solución salina tamponada con fosfato (PBS)-glucosa (~150 μL).
- Inducción de neuronas (~5 días)
nota: Este protocolo de inducción (Figura 1A; diagrama de flujo) es altamente efectivo tanto para células madre pluripotentes inducidas (iPS) como para células madre embrionarias (ES) de pluripotencia validada (que se pueden analizar mediante tinción inmunohistoquímica de marcadores de pluripotencia bien caracterizados; Figura 1B).
- Utilice células madre embrionarias humanas H1 disponibles comercialmente en el paso de 52 (véase la Tabla de Materiales). Cultive las células en placas de 6 pocillos recubiertas con solución de matriz extracelular (~0,5 mg de solución de matriz por placa de 6 pocillos; ver Tabla de Materiales) utilizando medio de mantenimiento de células ES (ver Tabla de Materiales) e incubar las placas a 37 °C con 5% de CO2.
- En el día -2, separe las células madre embrionarias (80% confluentes) con 1 mL de solución de desprendimiento de células (ver Tabla de Materiales) e incube a temperatura ambiente durante 10 min. Transfiera las células a un tubo; lave el pocillo con 2 mL de medio y combine en el mismo tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, resuspender el pellet en el medio y colocar las celdas en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz con una densidad de siembra de 1 x 105 celdas por pocillo.
- En el día -1, agregue lentivirus que expresen Ngn2 más PuroR y rtTA junto con polibreno (8 μg/ml) a las células madre embrionarias en un medio de mantenimiento fresco para células madre embrionarias (ver Tabla de materiales). El número exacto de virus debe determinarse mediante títulos reales o la titulación. Por lo general, agregamos 5 μL de cada virus por pocillo en una placa de 6 pocillos.
- En el día 0, agregue Doxiciclina (2 μg/mL, para activar la expresión de Ngn2) en el medio Eagle modificado/mezcla de nutrientes F-12 (DMEM-F12) de Dulbecco con suplemento de N2 sin morfógenos.
- El día 1, agregue puromicina en medio fresco de DMEM-F12 más N2 y doxiciclina, hasta la concentración final de medio de 1 μg/mL. Seleccione las células transducidas en puromicina durante al menos 24 h. Es posible que se requiera una concentración más alta de puromicina (hasta 5 μg/mL) y un período de selección más largo (hasta 48 h) para eliminar adecuadamente las células subtransducidas si el título del virus es bajo.
- En el día 2, separe las neuronas diferenciadoras con solución de desprendimiento de células (ver Tabla de Materiales), y vuelva a colocarlas en placas de 24 pocillos (entre 80.000 y 200.000 células/pocillo) recubiertas con solución de matriz (ver Tabla de Materiales), y manténgalas en medio neurobasal-A (NBA)/B27 sin doxiciclina. La densidad de siembra es crítica.
- En esta etapa, las neuronas separadas pueden congelarse en un medio de congelación comercial especializado (ver Tabla de Materiales) y almacenarse en nitrógeno líquido hasta por 3 meses. Las neuronas puras se pueden platear teniendo en cuenta la muerte celular típica de ~15%-20% después del deshielo, cultivadas solas o co-cultivadas con otros tipos de células cerebrales (ver paso 3.2.3. para el co-cultivo con OPCs).
- Cultivo de iNs puros en las placas recubiertas con soluciones extracelulares basadas en matrices según las instrucciones del fabricante (véase la tabla de materiales). La morfología piramidal característica debería ser evidente para el día 4 (y el día 6; Figura 1C). La formación de sinapsis se puede detectar ya entre los días 14 y 16 y es prominente en el día 24 mediante tinción inmunohistoquímica con marcadores pre y postsinápticos estándar. (Figura 1D; marcado con el marcador presináptico Sinapsina 1 y el marcador dendrítico Map2).
>2. Inducción de células precursoras de oligodendrocitos humanos (OPCs) a partir de células madre pluripotentes y maduración de oligodendrocitos
- Generación de células progenitoras neuronales (NPC): protocolo monocapa (~7 días). Consulte la Figura 2A para ver el diagrama de flujo.
- Cultivo de células madre embrionarias humanas H1 como se ha descrito anteriormente (véase el paso 1.2.1) y transdiferenciarlas en células progenitoras neurales (NPC) mediante un enfoque establecido llamado SMADi dual, con inhibidores de moléculas pequeñas para múltiples vías de señalización. Aquí utilizamos un kit comercial ampliamente aceptado y seguimos el protocolo monocapa proporcionado por el fabricante (ver Tabla de Materiales).
- En el día -1, coloque 0,5–1 x 106 celdas por pocillo en una placa de 6 pocillos recubierta por una solución de matriz reducida en factor de crecimiento (ver Tabla de Materiales; ~0,5 mg de solución de matriz por placa de 6 pocillos) con medio de mantenimiento de celda ES (ver Tabla de Materiales). Esta solución de matriz reducida con factor de crecimiento se utiliza para recubrir todas las placas que se utilizarán en los siguientes pasos.
- En el día 0, tratar las células durante 24 h con un medio de mantenimiento de células madre embrionarias (ver Tabla de materiales) suplementado con DMSO al 2%.
- En los días 1 a 6, cambie el medio completo por un medio de inducción neural tibio (37 °C) que contenga los inhibidores de SMAD del kit comercial (consulte la tabla de materiales). Si las células se dividen y alcanzan la confluencia antes del día 7, páselas a la densidad de siembra de 0,5-1 x 106, como se describió anteriormente en el paso 2.1.2.
- En el día 7, pase los NPC usando solución de desprendimiento de celdas (ver Tabla de Materiales) y placa a una densidad de siembra de 1-2 x 105 celdas/pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Ensaye la eficiencia de diferenciación mediante tinción inmunohistoquímica (IHQ) para la ausencia de marcador de pluripotencia, el factor de transcripción de unión a octámero 4 (OCT4), por ejemplo, y la presencia de marcadores NPC como la caja pareada 6 (PAX6), la nestina y el factor de transcripción 1 de la región determinante del sexo Y-box (Sox1).
- En esta etapa, los NPC desprendidos se pueden congelar en los medios de congelación comerciales especializados en NPC (ver Tabla de Materiales) y almacenarse en nitrógeno líquido hasta por 3 meses. Después de congelarse y descongelarse por una vez, los NPC aún conservan la multipotencia para dar lugar a neuronas, astrocitos y OPC con protocolos confiables.
- Generación de células precursoras de oligodendrocitos (OPC) (~7 días). Consulte la Figura 2A para ver el diagrama de flujo.
- En el día 7, pase las NPC usando una solución de desprendimiento de células (ver Tabla de Materiales) y póngalas a una densidad de siembra de 1-2 x 105 celdas por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio de inducción neural caliente (37 °C) más inhibidores de SMAD del kit comercial (ver Tabla de Materiales).
- El día 8, prepare una solución de dimetilsulfóxido (DMSO) al 1% en el medio de diferenciación OPC y trate las NPC plateadas durante 24 h. El medio de diferenciación OPC está compuesto por: medio DMEM/F12, suplemento de N2 al 1%, suplemento de B27 al 1%, factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) a 20 ng/mL, agonista suavizado (SAG) a 1 μM, factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA) a 10 ng/mL (ver Tabla de Materiales).
- En el día 9, reemplace el medio con un medio de diferenciación OPC nuevo sin DMSO. Alimente las células cada dos días hasta el día 15. Si las células alcanzan la confluencia antes del día 15, páselas a la densidad de siembra de 1–2 x 105 células por pocillo, tal como se describe en el paso 2.2.1.
- En el día 14, placa OPC en medio de diferenciación OPC a una densidad de 1–2 x 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos.
- En esta etapa (día 15), las células analizan la presencia de marcadores específicos de OPC mediante tinción IHQ o qPCR (p. ej., O4, factor de transcripción del linaje de oligodendrocitos [Olig]-1/2, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina/antígeno neuronal-glial 2 [CSPG4/Ng2[, NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas [PDGFRa]; Figura 2B) y por la ausencia de marcadores NPC (Pax6 o Nestin; Figura 2D). Por lo general, detectamos la inmunorreactividad de O4 en más del 95% de las células en el día 15. De particular relevancia para la enfermedad de Alzheimer, la expresión de APP (proteína precursora de amiloide), BACE1 (la proteasa de procesamiento β-secreatasa 1) y el péptido amiloide-β (Aβ) es abundante en las OPC (Figura 2F).
>3. Co-cultivo de neuronas inducidas humanas (iNs) y células precursoras de oligodendrocitos (iOPCs)
- Recubrimiento iOPC (~3 días)
- Placa de iOPC en el día 14 a una densidad de 1 x 105 células por pocillo en una placa de 24 pocillos (como se describe anteriormente en el paso 2.2.4.) en un medio de diferenciación OPC (como se describe en el paso 2.2.2.).
- Configuración de co-cultivo iN-iOPC
- En el día 15, separe las neuronas humanas inducidas en el paso del día 2 después de la selección de puromicina (como se describe en el paso 1.2.6.) con una solución de desprendimiento celular (ver Tabla de materiales).
- Agregue neuronas a las OPC cultivadas, colocando la siembra a la densidad de siembra de 2 x 105 células por pocillo en la placa de 24 pocillos con OPC en crecimiento (del paso 3.1.1). Utilice el medio de cocultivo que contiene medio Neurobasal-A, suplemento de B27 al 2% y 100 ng/mL de triyodotironina T3. Cambie el medio al día siguiente y luego cada dos días a partir de entonces. Si las OPC proliferan demasiado rápido y alcanzan la confluencia en menos de 3 días, agregue arabinósido de citosina (Ara-C) a una concentración de 2-5 μM. En la Figura 3A se muestra una imagen representativa de las iNs e iOPCs cultivadas en cocultivo después de 7 días de neuronas.
- Utilice neuronas congeladas preparadas como se describe anteriormente en el paso 1.2.7 para el cocultivo con OPC. Congelación y descongelación de placas de neuronas a una densidad más alta de 3 x 105 células por pocillo.
- Después de los días 14-16 en cocultivos, la formación de sinapsis en iNs se puede observar mediante la tinción IHQ de marcadores pre y postsinápticos, y para el día 21 los puntos sinápticos deberían ser abundantes (Figura 3C) y las actividades neuronales se pueden registrar de manera confiable.
- A partir del día 21, se analizan las células en busca de marcadores específicos de OL (por ejemplo, proteína básica de mielina [MBP] y proteína proteolípida 1 [PLP1]). Hacia el día 28, normalmente observamos el fenómeno de envoltura de los axones iN por procesos iOL, marcados por tinción IHC para marcadores específicos (Figura 3B; neurofilamento [NF] para los axones iN y MBP para los procesos iOPC).
