1. Preparación experimental
- Preparación de placas recubiertas con matriz de membrana basal (BMM).
nota: BMM se solidifica más rápidamente a temperaturas más cálidas. Las placas deben prepararse rápidamente y colocarse inmediatamente a 4 °C para su almacenamiento.
- Descongele el BMM (consulte la tabla de materiales) en hielo, a 4 ° C durante al menos 2 h o durante la noche.
- Mezcle el medio Eagle modificado (DMEM)/F12 y BMM de Dulbecco hasta una concentración final de 80 μg/mL. Distribuir la solución de BMM en placas de cultivo de tejidos (1 mL para placas de 35 mm y 2 mL para placas de 60 mm) e incubar a 37 °C durante al menos 1 h o toda la noche antes >NOTA: Los platos no utilizados se pueden almacenar a 4 °C durante 2 semanas.
- Prepare placas recubiertas de poli-L-ornitina/laminina (PLO/laminina).
- Prepare 20 μg/mL de PLO (consulte la Tabla de materiales) en solución salina tamponada con fosfato estéril de Dulbecco (DPBS+/+) y agregue 1 mL a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar durante la noche a 37 °C en la incubadora.
- Al día siguiente, aspire el PLO con un aspirador de vacío y lave dos veces con DPBS+/+. Secar al aire en el capó.
NOTA: Las placas secadas al aire pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas, envueltas en papel de aluminio, para su uso futuro.
- Prepare 10 μg/mL de laminina (consulte la Tabla de materiales) en DPBS+/+ y agregue 1 mL a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar al menos durante 3 h o toda la noche a 37 °C en la incubadora.
- Aspire la laminina con un aspirador de vacío y agregue 1 mL de DPBS+/+ medio o estéril.
NOTA: El recubrimiento de laminina no debe secarse. Para evitarlo, se debe añadir inmediatamente PBS o un medio de cultivo adecuado. Las placas recubiertas pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Prepare la solución de paso de PSC.
- Disolver 11,49 g de cloruro de potasio (KCl) y 0,147 g de citrato de sodio dihidratado (HOC(COONa) (CH2COONa)2*2H2O) en 400 mL de agua estéril de grado de cultivo celular (ver Tabla de Materiales).
- Mida el volumen de la solución y regístrelo como el volumen inicial (Vi).
- Mida la osmolaridad y ajústela a 570 mOsm agregando agua estéril de grado de cultivo celular utilizando la fórmula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
- Filtrar-esterilizar la solución con un filtro de 0,20 μm y hacer alícuotas de 10 mL. Almacene las alícuotas a temperatura ambiente (RT) hasta por 6 meses.
- Prepare el medio de células madre pluripotentes (PSC).
NOTA: Las iPSC se mantienen en un medio que contiene factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) estable al calor (ver Tabla de Materiales), lo que proporciona un horario de alimentación sin fines de semana. No se han probado otros medios PSC disponibles comercialmente para este protocolo.
- Descongele el suplemento medio de PSC durante la noche a 4 °C.
- Agregue 10 mL de suplemento de medio PSC a 500 mL de medio PSC basal. Prepare 25 mL de alícuotas y almacene a -20 °C.
NOTA: Las alícuotas congeladas pueden almacenarse a -20 °C durante 6 meses. Las alícuotas descongeladas deben almacenarse a 4 °C y utilizarse en un plazo de 2 semanas. Las células se pueden congelar para su almacenamiento a largo plazo en un medio PSC con un 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Prepare el medio de descongelación PSC.
- Suplementar el medio PSC con 50 nM de cromán, 1,5 μM de emicasano, 1x suplemento de poliamina y 0,7 μM de trans-ISRIB (cóctel CEPT) (ver Tabla de Materiales).
- Filtre-esterilice con un filtro de 0,20 μm y almacene a 4 °C durante un máximo de 4 semanas.
- Prepare pipetas de vidrio estirado.
- Tire de las pipetas Pasteur de vidrio de 22,9 cm (9 pulgadas) en dos piezas por encima de un mechero Bunsen, ~2 cm por debajo del cuello, creando dos pipetas, con el lado más delgado siendo ~4 cm más corto que el otro.
- Con la ayuda de la llama, dobla las puntas del lado tirado para crear una "r" suave.
- Coloque las pipetas extraídas en las fundas del autoclave y en el autoclave para la esterilización.
- Preparar el medio de diferenciación cerebeloso (MDL).
- Mezcle el Dulbecco Medium Modificado de Iscove (IMDM) y la mezcla de nutrientes F12 de Ham en una proporción de 1:1. Complemente la mezcla con 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina, 1% (v/v) de concentrado de lípidos químicamente definidos, 0,45 mM de 1-tio-glicerol, 15 μL/mL de apotransferrina, 5 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) y 7 μg/mL de insulina (ver Tabla de Materiales).
- Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm, almacenar a 4 °C y utilizar en el plazo de 1 mes.
- Preparar el medio de maduración cerebeloso (MMC).
- Complemente el medio neurobasal con 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina y 1x suplemento de N-2 (ver Tabla de Materiales).
- Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm, almacenar a 4 °C y utilizar en un plazo de 2 semanas.
>2. Cultivo iPSC sin alimentador
- Descongele las celdas siguiendo los pasos a continuación.
- Coloque una placa BMM (paso 1.1) en la incubadora a 37 °C para que se gelifique durante al menos 1 h o toda la noche antes de descongelar las células.
- Precalentar 10 mL de medio de descongelación PSC (paso 1,5) a 37 °C.
- Transfiera el criovial con células de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 °C.
NOTA: Para evitar generar una fuente de contaminación en el espacio de cultivo celular, no se recomienda el uso de un baño de agua estándar. En su lugar, el agua dulce se puede calentar en un vaso de precipitados pequeño a 37 °C para generar un baño de agua de un solo uso.
- Cuando quede un pequeño trozo de hielo en el tubo, retírelo del baño de agua, seque el tubo y rocíe con etanol al 70%. Transfiera el tubo a la campana y use una pipeta serológica de 2 mL o 5 mL (consulte la Tabla de materiales) para transferir suavemente las células a un tubo cónico de 15 mL.
- Agregue 8 mL de medio de descongelación PSC a las células gota a gota mientras gira el tubo cónico. Centrífuga a 200 x g durante 5 min en RT.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar el pellet de celda. Vuelva a suspender las células en 2 mL de medio de descongelación de PSC.
- Aspire el BMM de la placa y agregue las celdas resuspendidas gota a gota por toda la placa para una distribución uniforme.
- Coloque la placa en la incubadora a 37 °C, 5% de CO2. Refresque el medio al día siguiente con el medio PSC. Después de eso, cambie el medio diariamente.
- Mantenga las celdas siguiendo los pasos a continuación.
- Precalentar el volumen necesario de medio PSC a 37 °C (por ejemplo, 1 mL de medio por placa de 35 mm).
- Investigue las placas en busca de células diferenciadas o colonias y extraiga las células diferenciadas con una pipeta de vidrio estirado (paso 1.6).
NOTA: Las colonias de iPSC tienen bordes lisos con células morfológicamente idénticas.
- Cambie el medio gastado diariamente y pase cada 3-4 días o cuando se alcance el 70% de confluencia.
- Pasa las celdas.
- Coloque la cantidad necesaria de placas BMM en la incubadora durante al menos 1 h o toda la noche antes de pasar. Precalentar la cantidad necesaria de medio PSC (paso 1.3) a 37 °C.
- Con una pipeta de vidrio extraída, limpie las células o colonias diferenciadas.
- Aspire el medio gastado con un aspirador de vacío y agregue medio de disociación PSC, 1 mL por plato de 35 mm. Incubar a 37 °C durante 1-3 min.
NOTA: Si las colonias se están levantando en la solución de paso de PSC antes de agregar el medio de PSC, se puede reducir el tiempo de incubación.
- Aspire la solución de paso PSC y agregue medio PSC precalentado.
- Con una punta de pipeta estéril de 200 μL, raye las líneas paralelas entre sí en una dirección, gire la placa 90° y haga un segundo conjunto de líneas de rayado perpendiculares a las anteriores (formando un patrón de rayado cruzado a través de la placa).
- Aspire la solución BMM de las placas de ajuste. Recoja las colonias con una pipeta serológica y distribúyalas a nuevas placas BMM.
- Incubar a 37 °C, 5% de CO2. Cambie el medio a diario.
- Congela las células.
- Prepare los crioviales etiquetando el contenido y esterilícelos bajo luz ultravioleta (UV) en la campana (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos.
- Prepare el medio de congelación PSC complementando el medio PSC con DMSO al 10% (v/v). Siga los pasos 2.3.2-2.3.5.
- Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL con una pipeta serológica de 5 mL y centrífugo a 200 x g durante 5 min en RT.
- Aspire con cuidado el medio y vuelva a suspender el pellet de celda en el medio de congelación PSC.
- Distribuir en crioviales. Coloque los viales en un recipiente de congelación y coloque el recipiente en un congelador de -80 °C.
- Al día siguiente, transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
>3. Diferenciación cerebelosa
NOTA: Antes de comenzar la diferenciación, las iPSCs se pasan a seis antenas de 35 mm y están listas para la diferenciación cuando están al 70% de confluencia. Cada placa de 35 mm se transferirá a un pocillo de la placa de 6 pocillos.
- El día 0, levante las colonias sanas de iPSC para la formación de EB.
- Agregue 1 mL de CDM (paso 1.7) suplementado con 10 μM Y-27632 y 10 μM SB431542 (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo de una placa de acoplamiento ultrabajo (ULA) de 6 pocillos y colóquela en la incubadora hasta que las colonias levantadas estén listas para ser añadidas a los pocillos.
- Limpie las células diferenciadas con una pipeta de vidrio estirado. Aspire el medio y agregue 1 mL de solución de paso PSC por cada plato de 35 mm. Incubar durante 3 min a 37 °C, aspirar, y añadir 2 mL de CDM suplementado con 10 μM de Y-27632 y 10 μM SB431542.
nota: Si las colonias despegan en la solución de paso de PSC antes de agregar CDM, se puede reducir el tiempo de incubación.
- Bajo un microscopio invertido de luz transmitida, levante suavemente las colonias con el borde doblado de la pipeta de vidrio estirado con un aumento de 4x. Una vez que se levanten todas las colonias, transfiéralas suavemente a un pocillo de la placa ULA de 6 pocillos con una pipeta serológica de 10 mL. Repita este proceso para cada placa iPSC. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2.
nota: Si las colonias son demasiado grandes o están fusionadas, se pueden cortar en rodajas con la punta de la pipeta de vidrio estirado para crear EB más pequeños.
- El día 2, agregue FGF2 a cada pocillo hasta una concentración final de 50 ng/mL.
nota: El FGF2 utilizado para la diferenciación cerebelosa no es termoestable. Este protocolo no ha sido probado con FGF2 termoestable.
- El día 7, haz un cambio de 1/3 medio. Para 3 mL de medio total en un pocillo, con una pipeta de 1.000 μL, aspire suavemente 1 mL de medio gastado y reemplácelo con 1 mL de CDM fresco. Incubar los EB durante 7 días.
- El día 14, aspire suavemente casi todo el medio gastado con una pipeta de 1.000 μL. Para garantizar un daño mínimo a los EB, gire la placa para reunir todos los EB en el centro de la placa y, a continuación, incline la placa y aspire lentamente desde el borde.
- A medida que la cantidad media disminuye, coloque lentamente el plato plano y continúe aspirando. Deje suficiente medio para evitar que se sequen los EB. A continuación, añadir 3 mL de CDM fresco suplementado con 10 μM de Y-27632. Transfiera los EB con una pipeta serológica de 10 mL a una placa recubierta de PLO/laminina (paso 1.2).
nota: Dependiendo de la aplicación posterior, los EB se pueden transferir a una placa de PLO/laminina de 6 pocillos o los EB individuales se pueden transferir a un solo pocillo de una placa o cubreobjetos de 24 pocillos recubierta de PLO/laminina.
- El día 15, aspire el medio y reemplácelo con CDM.
nota: Es importante agregar suficiente medio a los pocillos para asegurar suficiente medio entre las alimentaciones, ya que, con el tiempo, habrá evaporación (por ejemplo, para un pocillo en una placa de 6 pocillos, agregue 3 mL de medio). Si el medio ha comenzado a acidificarse (se vuelve claro y amarillo), refresque el medio incluso si no está en el horario de alimentación hasta el final del protocolo.
- El día 21, aspire el medio gastado y reemplácelo con CMM. El día 28, cambie el medio por una MMC nueva. En el día 35, coseche las células para aplicaciones posteriores.
