Una técnica para generar una monocapa 2D de células cerebelosas a partir de células madre pluripotentes inducidas

Resumen

Fuente: Madencioglu, D. A., et al. Modelando el desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2D.J. Vis. Exp. (2022).

Este video muestra un protocolo para diferenciar células madre pluripotentes inducidas humanas en progenitores cerebelosos. Consiste en transferir colonias de células madre a una placa de unión ultra baja para formar cuerpos embrioides, promoviendo la diferenciación con factores de crecimiento, y luego transferir los cuerpos embrioides a una placa recubierta de matriz para su adhesión. Los pasos posteriores implican la inducción de la migración celular y la adición de un medio de maduración para guiar el desarrollo de precursores neuronales cerebelosos glutamatérgicos y GABAérgicos y progenitores de células de Purkinje.

Protocolo

1. Preparación experimental

1. Preparación de placas recubiertas con matriz de membrana basal (BMM).
   nota: BMM se solidifica más rápidamente a temperaturas más cálidas. Las placas deben prepararse rápidamente y colocarse inmediatamente a 4 °C para su almacenamiento.
   1. Descongele el BMM (consulte la tabla de materiales) en hielo, a 4 ° C durante al menos 2 h o durante la noche.
   2. Mezcle el medio Eagle modificado (DMEM)/F12 y BMM de Dulbecco hasta una concentración final de 80 μg/mL. Distribuir la solución de BMM en placas de cultivo de tejidos (1 mL para placas de 35 mm y 2 mL para p....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipeta serológica de 10 mL	Fisher Científico	13-678-26D
1-tio-glicerol	sigma	M6145
Pipeta serológica de 2 mL	Fisher Científico	13-678-26B
Unidad de filtro de 250 ml, 0,2 μm aPES, 50 mm de diámetro	Fisher Científico	FB12566502
Plato de cluture de tejido de fácil agarre de 35 mm	halcón	353001
Pipeta serológica de 5 mL	Fisher Científico	13-678-25D
Plato de cultivo de tejidos de fácil agarre de 60 mm	halcón	353004
Placas de fijación ultra bajas de 6 pocillos	Corning	3471
Pipetas Pasteur desechables de 9"	Fisher Científico	13-678-20D
Apo-transferrina	sigma	T1147
Albúmina sérica bovina (BSA)	sigma	A9418
Agua apta para cultivos celulares	Cytiva	SH30529.02
Concentrado lipídico químicamente definido	Gibco	11905031
Croma 1	caimán	34681
Clase II, Tipo A2, Cabina de seguridad biológica	NuAire, Inc.	NU-540-600	Capucha, luz ultravioleta
Placa Costar de 24 pocillos, tratada con TC	Corning	3526
Placa Costar de 6 pocillos, tratada con TC	Corning	3516
DMEM	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO (sulfóxido de dimetlio)	sigma	D2438
DPBS+/+	Gibco	14040133
Emricasan	caimán	22204
Kit de reprogramación de iPSC episomal Epi5	Tecnologías de la Vida	A15960
Esencial 8-Flex	Gibco	A2858501	Medio PSC con FGF2 termoestable
Suero fetal bovino - Premium Select	Biológicos de Atlanta	S11150
FGF2	Peprotech	100-18B
Suplemento GlutaMAX	Gibco	35050061	Suplemento de L-alanina-L-glutamina
Mezcla de nutrientes F12 del jamón	Gibco	11765054
Incubadora de CO2 HERAcell VIOS 160i	Termo Científico	50144906
IMDM	Gibco	12440053
insulina	Gibco	Año 12585
Proteína de ratón laminina	Gibco	23017015
Matriz Matrigel	Corning	354234	Matriz de membrana basal
MEM-NEAA	Gibco	11140050
Mini centrífuga	Labnet Internacional	C1310	Mini centrífuga de sobremesa
Suplemento N-2	Gibco	17502-048
Medio neurobasal	Gibco	21103049
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
PFA 16%	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710
Suplemento de poliamina	sigma	P8483
Poli-L-Ornitina (PLO)	sigma	3655
Cloruro de potasio	sigma	746436
SB431542	sigma	54317
Transparente a través de bolsas autosellables	Esteronado	SS-T2 (90x250)	Bolsas de autoclave
Citrato de sodio dihidratado	Fisher Científico	S279-500
Filtros de jeringa, estériles, PES 0,22 μm, 30 mm de diámetro	Investigación Internacional de Productos	256131
Trans-ISRIB	caimán	Año 16258
Osmómetro de presión de vapor	Wescor, Inc.	Modelo 5520	osmómetro
Y-27632	Biogemas	1293823