Generación de neuronas y células gliales a partir de cuerpos embrioides derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Resumen

Fuente: Pistollato, F., et al. Protocolo para la Diferenciación de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas en Cultivos Mixtos de Neuronas y Glía para Pruebas de Neurotoxicidad. J. Vis. Exp.(2017)

Este video muestra el proceso de diferenciación de cuerpos embrioides (EBs) en agregados neuroepiteliales y su posterior división en células neuronales y gliales. Este método permite la generación eficiente de células neuronales y gliales in vitro, que sirven como sistemas de ensayo para las pruebas de toxicidad, así como para la evaluación de diferentes vías implicadas en la neurotoxicidad.

Protocolo

1. Diferenciación de HiPSC en neuronas mixtas y glía

NOTA: El procedimiento tarda aproximadamente 28 días en completarse, con los pasos principales descritos en la Figura 1.

1. Generación de cuerpos embrioides (EBs) (Días 0 → 1)
   NOTA: Este procedimiento requiere buenas habilidades manuales y precisión. Los fragmentos de colonias de HiPSC (células madre pluripotentes inducidas humanas) deben ser del mismo tamaño para obtener cuerpos embrioides (EB) homogéneos en los siguientes pasos. Las colonias morfológicamente diferenciadas (con grandes fracciones citoplasmáticas y pequeños nucléolos) deben descartarse.
   1. Refresque el medio hiPSC (placa de Petri de 3 mL/60 mm) antes de cortar las colonias indiferenciadas de hiPSC (aproximadamente 1 mm de diámetro, consulte la Figura 2A) en condiciones estériles.
   2. Corte las colonias indiferenciadas (como se muestra en la Figura 2A y la Figura 2B) en fragmentos de aproximadamente 200 μm x 200 μm usando una jeringa de 1 mL con una aguja de 30G. Utilice un microscopio estereoscópico con un aumento de 4X en una cabina de flujo laminar a temperatura ambiente.
   3. Separe los fragmentos de la colonia de la superficie de la placa con una pipeta de 200 μL pipeteando suavemente el medio por debajo para levantar las piezas.
   4. Transfiera todos los fragmentos desprendidos y el medio a un tubo de 15 ml con una pipeta de 1, 2 o 5 ml.
   5. Enjuague el plato con 2 mL de medio hiPSC completo para recuperar todos los fragmentos.
   6. Centrifugar a 112 x g durante 1 min.
   7. Aspirar el sobrenadante y resuspender suavemente los fragmentos en 5 mL de medio hiPSC EB completo (ver Tabla de Materiales).
   8. Coloque los fragmentos de la colonia en una placa de Petri de fijación ultrabaja de 60 mm (placa de Petri de 5 mL/60 mm).
   9. Incubar la placa de Petri durante la noche a 37 °C y 5% de_CO2.
   10. Al día siguiente (Día 1), recoja los EB y su medio en un tubo de 15 ml con una pipeta de 1, 2 o 5 ml.
   11. Centrifugar los EB a 112 x g durante 1 min.
   12. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente los EB en 5 mL de medio EB hiPSC completo con una pipeta de 1, 2 o 5 mL.
   13. Vuelva a colocar los EB en una nueva placa de Petri de fijación ultrabaja de 60 mm (placa de Petri de 5 mL/60 mm).
   14. Incubar la placa de Petri durante la noche a 37 °C y 5% de_CO2.
2. El día 1, cubra los platos con matriz de membrana basal (por ejemplo, matrigel, denominado en lo sucesivo "matriz estándar") o cualquier otro sustrato proteico adecuado (por ejemplo, laminina).
   1. Almacene la matriz estándar (consulte la tabla de materiales) a -80 °C en alícuotas de 200 μL utilizando tubos fríos de 1,5 ml y pipetas frías de 5 o 10 ml.
   2. Descongele 200 μL de matriz estándar en hielo.
   3. Diluir 200 μL de matriz patrón en 20 mL de medio basal (DMEM/F12) (dilución 1:100).
   4. Cubra las placas de Petri de 60 mm con esta solución (5 mL/placa).
   5. Incubar las placas recubiertas a 37 °C durante la noche.
      nota: Estas placas se utilizarán para colocar los EB (alrededor de 50 EB/plato) y generar agregados neuroepiteliales (rosetas); Consulte el paso 1.3.
3. Generación de agregados neuroepiteliales (rosetas) (Días 2 → 7)
   1. El día 2, retire la solución de recubrimiento de matriz estándar de las placas de Petri de 60 mm (no es necesario enjuagar las placas) y llénelas con 5 mL/placa de medio de inducción neuroepitelial (NRI) completo; consulte la Tabla de materiales.
   2. Transfiera los EB flotantes (del paso 1.1.14) a placas recubiertas (~50 EBs/plato) utilizando una pipeta de 200 μL bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 4x y colóquelo en una cabina de flujo laminar.
      nota: Es fundamental seleccionar EB homogéneos y de tamaño mediano (~200-300 μm de diámetro). Es posible que los EB demasiado pequeños no sobrevivan bien durante la diferenciación neuroectodérmica, mientras que los EB demasiado grandes tienden a sufrir necrosis central.
   3. Incubar las placas a 37 °C y 5% de CO₂.
   4. Al día siguiente (Día 3), revise las placas bajo el microscopio con un aumento de 10x para asegurarse de que todos los EB estén conectados.
   5. Realice suavemente un cambio total de medio con un medio NRI completo.
   6. Cambie el medio NRI cada dos días hasta el día 7, cuando los agregados neuroepiteliales (rosetas) deben ser visibles.
   7. En el día 7, aplique la matriz estándar (o laminina), como se describe en el paso 1.2, en cualquier placa o formato de plato requerido: placas de 96 pocillos (100 μL/pocillo), placas de 24 pocillos (250 μL/pocillo), placas de 12 pocillos (500 μL/pocillo), chips MEA (para actividad eléctrica, 1 mL/chip de un solo pocillo) o placas de Petri de 60 mm (4 mL/plato).
   8. Incubar las placas/placas recubiertas durante al menos 2 h a 37 °C y 5% de_CO2.
4. Disociación en roseta y diferenciación neuronal (Días 8 → 28)
   NOTA: Este procedimiento requiere buenas habilidades manuales y precisión. Para evitar la recolección de células mesodérmicas y endodérmicas, solo se deben disociar y recolectar las estructuras en forma de roseta de ectodermo.
   1. El día 8, corte las estructuras en forma de roseta en fragmentos bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10X en condiciones estériles. Use una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G. Tenga en cuenta que las rosetas tienden a desprenderse del plato cuando se tocan con la aguja fácilmente.
   2. Complete el desprendimiento de los fragmentos de roseta con una pipeta de 200 μL.
   3. Transfiera la placa debajo de la campana de flujo laminar y recoja los fragmentos de roseta y su medio en un tubo cónico de 15 mL con una pipeta de 1, 2 o 5 mL. Enjuague el plato con 2 mL de medio NRI para recuperar todos los fragmentos.
   4. Gira los fragmentos de roseta a 112 x g durante 2 min.
   5. Aspirar el sobrenadante.
   6. Vuelva a suspender suavemente el pellet en 1 mL de 1x DPBS (sin calcio ni magnesio) y pipetee suavemente los fragmentos de roseta hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL para disociarlos parcialmente.
   7. Agregue 4 mL de medio NRI completo y cuente las células usando azul de tripán y un contador de células automatizado (consulte la Tabla de Materiales)
      nota: Diluir 20 μL de suspensión celular en 20 μL de azul de tripán. Este paso puede omitirse si las células no se pueden llevar a una suspensión de una sola célula. Si los fragmentos de roseta no se ven completamente disociados, los fragmentos de roseta derivados de una placa de aproximadamente 50 EBs/60 mm pueden ser resuspendidos en 50 mL de medio NRI completo y plateados, como se indica en la Tabla 1.
   8. Aspire la solución de recubrimiento de matriz estándar (o laminina) de las placas de Petri, placas y/o chips MEA (del paso 1.3.7). No dejes que se sequen.
   9. Coloque las células en un medio NRI completo de acuerdo con el plan de estudio (alrededor de 15.000 células/^cm2; consulte la Tabla 1 para conocer las indicaciones del volumen de siembra).
   10. Incubar las placas durante la noche a 37 °C y 5% de CO₂.
   11. En el día 10, realice un cambio total del medio utilizando un medio de diferenciación neuronal completo (ND); consulte la Tabla de Materiales.
   12. Refresque el medio ND completo dos veces por semana hasta el día 28.

Tabla 1.

Nota sobre la densidad de recubrimiento de roseta disociada: si los fragmentos de roseta no parecen completamente disociados, para alcanzar una densidad de recubrimiento de celdas de aproximadamente 15.000 células/cm2, los fragmentos de roseta disociados derivados de aproximadamente 50 EBs/1 x plato de 60 mm se pueden resuspender en 50 mL de medio NRI completo y recubrir de la siguiente manera (dependiendo del formato de la placa):

Placas multipocillo / MEA	Área de crecimiento (cm2/pozo)	Volumen de la suspensión de la célula a placa por pocillo (o chip MEA)	Número máximo de placas que se pueden enchapar (con 50 ml de suspensión celular)
96 pozos	0.3	100 ul	5
48 pozos	0.7	220 ul	4
24 pozos	número arábigo	625 UL	3
12 pozos	4	1,25 ml	3
6 pozos	10	3.125 ml	número arábigo
Chip MEA de un solo pocillo	3.5	1,1 ml	45

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del protocolo de diferenciación neuronal. (Parte superior) Las colonias de IMR90-hiPSC se pueden cortar en fragmentos para formar cuerpos embrioides (EB). Después de 2 días in vitro (DIV), los EB se pueden sembrar en placas recubiertas de laminina o matriz estándar y cultivarse en presencia de medio de inducción neuroepitelial (NRI) para generar derivados...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
medio hiPSC EB:
DMEM de eliminación	Termo-Fisher	10829-018	(Paso 2.1.7)
Reemplazo de suero knockout (KOSR)	Termo-Fisher	10828-028	Concentración final del 20% (Paso 2.1.7)
Aminoácidos no esenciales	Termo-Fisher	11140-035	(Paso 2.1.7)
Penicilina/Estreptomicina	Termo-Fisher	Números 15140-122	Concentración final de 50 U/mL (Paso 2.1.7)
Solución de L-glutamina 200 mM	Termo-Fisher	25030-081	Concentración final de 2 mM (Paso 2.1.7)
β-Mercaptoetanol	Termo-Fisher	31350-010	Concentración final de 50 μM (Paso 2.1.7)
Medio de inducción neuroepitelial completo (NRI):
DMEM/F12	Termo-Fisher	3133-038	(Paso 2.3.1)
Aminoácidos no esenciales	Termo-Fisher	11140-035	(Paso 2.3.1)
Suplemento N2	Termo-Fisher	17502-048	(Paso 2.3.1)
Penicilina/Estreptomicina	Termo-Fisher	Números 15140-122	Concentración final de 50 U/mL (Paso 2.3.1)
Heparina Grado I-A, ≥180 unidades USP/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	Concentración final de 2 μg/ml (Paso 2.3.1)
bFGF	Termo-Fisher	13256-029	Concentración final de 20 ng/ml añadida antes de usar (Paso 2.3.1)
Matrigel Membrana Basal Matrix	Corning	354234	1:100 (paso 2.2). Descongele Matrigel en hielo, prepare 200 ul alícuotas y guárdelas a -80 ° C. Para el recubrimiento, diluir 200 ul alícuotas en 20 ml de medio DMEM/F12 frío.
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	1:100 (paso 2.2). Diluir en PBS 1X.
Medio de diferenciación neuronal completo (ND):
Medio Neurobasal	Termo-Fisher	21103049	(Paso 2.4.11)
Suplementos B-27 (50x)	Termo-Fisher	17504044	(Paso 2.4.11)
Suplemento N2	Termo-Fisher	17502-048	(Paso 2.4.11)
Penicilina/Estreptomicina	Termo-Fisher	Números 15140-122	Concentración final de 50 U/mL (Paso 2.4.11)
GDNF (en	Termo-Fisher	PHC7045	Concentración final de 1 ng/ml. Se añade antes de usar. (Paso 2.4.11)
BDNF	Termo-Fisher	PHC7074	Concentración final de 2,5 ng/ml. Se añade antes de usar. (Paso 2.4.11)

inglés)