Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Disociación de las células ventrales del mesencéfalo
- Transfiera las piezas del mesencéfalo ventral bajo una campana de flujo laminar. Retirar la solución salina balanceada de Hanks (HBSS) y añadir 1 ml de ácido tripsina-etilendiaacético al 0,05% (tripsin-EDTA) precalentado (37 ºC) en el tubo cónico (volúmenes suficientes para hasta 12 piezas de mesencéfalo ventral). Incubar el tejido a 37 ºC durante 5-10 min.
- Retire la tripsina-EDTA bajo el capó y añada 1 ml de medio de desactivación (el suero desactivará la tripsina) al tejido.
- Retire el medio de desactivación y lave el pañuelo en 1 ml del medio completo dos veces.
nota: Para evitar el descarte de las células disociadas, evite extraer todo el medio del tubo y pipetear el tejido.
- Añadir 1 ml de medio completo y triturar el tejido con una pipeta de vidrio pulido al fuego. Evite la formación de burbujas y continúe triturando hasta lograr una suspensión de una sola celda.
NOTA: Por lo general, se requieren de 8 a 10 pasadas a través de la punta restringida para una disociación completa.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y retirar el medio.
- Vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio completo pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo hasta cuatro veces.
>2. Placas de células ventrales del mesencéfalo
- Mezcle 10 μl de la suspensión celular con 90 μl de solución de azul de tripán y cuente el número de células con un hemocitómetro.
nota: La viabilidad de las células también se puede comprobar en esta etapa.
- Coloque las tapas de los tubos de microcentrífuga esterilizadas en placas de Petri de 100 mm y transfiera los cubreobjetos recubiertos de poli-L-ornitina/laminina, utilizando pinzas, uno a la vez encima de las tapas.
nota: No lave los cubreobjetos y evite secar la laminina, ya que esto puede causar cultivos desiguales y disminuir la capacidad de supervivencia de las células.
- Ajuste el volumen a 1.500 células por 1 μl añadiendo un medio completo y 100 μl (un total de 150.000 células) de la suspensión de células en la parte superior de cada cubreobjetos (el volumen es óptimo para cubrir la superficie del cubreobjetos sin derrames). Cierre las placas de Petri e incorpórelas durante 1 hora en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada (37 °C, 5% CO2).
nota: PASO CRÍTICO: Este paso es necesario para mejorar la adhesión y la viabilidad de las células y para aumentar el número de cubreobjetos por embrión. Alternativamente, las celdas pueden transferirse directamente a los pozos (que contienen cubreobjetos), pero el número de celdas debe aumentarse a 350.000 por pocillo (en lugar de 150.000). En otras palabras, usando este método, se pueden adquirir de 8 a 10 cubreobjetos, mientras que la transferencia directa produce alrededor de 3-4 cubreobjetos debido a las celdas que se adhieren a las placas (al lado o debajo de los cubreobjetos). La viabilidad media de los cultivos que utilizaron este método fue de alrededor del 90%.
>3. Crecimiento y mantenimiento de la cultura
- Después de 1 hora de incubación, transfiera cuidadosamente los cubreobjetos, incluido el medio, a placas de 24 pocillos que contengan 400 μl de medio completo precalentado (a 37 ºC) (volumen total: 500 μl). Incubar las células durante la noche (O/N) a 37 ºC.
- Dentro de las 24 horas posteriores a la incubación de los pocillos, agregue suavemente 500 μl de medio completo en cada pocillo.
NOTA: Las primeras horas son la etapa más crítica para la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas, y el número de células supervivientes no cambia significativamente más allá de este punto.
- No agregue medios adicionales a los cultivos durante las primeras dos semanas o hasta que el medio se vuelva amarillo. Si el cultivo dura más de dos semanas o el color del medio cambia a amarillo, cambie la mitad del medio (500 μl) por un medio fresco y completo precalentado (normalmente cada dos semanas)
nota: Las neuronas dopaminérgicas dentro de los cultivos sobrevivirían durante más de seis semanas en estas condiciones.
