Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Obtención de muestras de tejido
NOTA: Un componente crítico de este protocolo requiere el manejo adecuado de la donación de tejido desde el momento de la autopsia. La viabilidad general de la muestra depende significativamente de minimizar el intervalo post-mortem (PMI), transferir inmediatamente el tejido al medio frío apropiado suplementado con antibióticos/antimicóticos, mantener la muestra en hielo húmedo durante todo el transporte y mantener la técnica estéril durante todo el protocolo.
- Tras la notificación de una donación inminente, prepare un kit de recolección de muestras. Usando una caja de envío con un contenedor aislado que se pueda usar directamente para el transporte de regreso de la muestra de tejido, incluya los siguientes materiales:
- Incluya materiales para la preparación estéril, incluidos guantes, paños y bisturíes estériles.
- Incluya de 8 a 10 tubos cónicos estériles de 50 mL que contengan 30 mL de medio de envío en el contenedor aislado con hielo o compresas frías.
nota: Si bien cualquier medio de cultivo celular estándar puede funcionar, la mejor viabilidad de la muestra se obtiene con Hibernate-A suplementado con antibiótico/antimicótico.
- Incluya cualquier otro tubo de muestra para otros análisis (por ejemplo, fijadores).
- Si la autopsia no se realizará en el sitio del investigador, incluya un documento que indique claramente cómo recolectar la muestra del tumor. Esto incluye detalles como el mantenimiento de la esterilidad, la conservación de los tubos de muestra sobre hielo húmedo y la inclusión de muestras del mesencéfalo y la médula, ya que las células tumorales suelen invadir estas regiones.
- Mantener la esterilidad durante la autopsia. Considere el cerebro estéril dentro del cráneo, por lo tanto, observe la técnica estéril (incluido el cambio de guantes) una vez que el cráneo esté abierto. Es fundamental evitar la contaminación con la piel y el cabello.
- Diseccionar el tumor desde el lado ventral (el "vientre" de la protuberancia, ver figura 1). Con un bisturí estéril, corte pequeños trozos de 1 cm del tumor y transfiéralos inmediatamente a un medio de envío frío (consulte la NOTA en el paso 1.1.2) y colóquelo en hielo húmedo. Coloque 10 mL de tejido en cada tubo, lo que da como resultado un volumen final de tejido y medios en cada tubo de 40 mL.
nota: En el caso del glioma pontino intrínseco difuso (GPID), el tumor infiltra difusamente la protuberancia y, con frecuencia, el resto del tronco encefálico. Como tal, recoja la mayor cantidad posible de la muestra, que generalmente incluye 3 a 4 tubos (30 a 40 ml de tejido) de la protuberancia y 1 a 2 tubos (10 a 20 ml de tejido) cada uno del mesencéfalo y la médula.
- Recolecta muestras del mesencéfalo y la médula yuxtapuestas a la protuberancia, que a menudo contienen muchas células tumorales.
- Después de la recolección de muestras, envíe las muestras durante la noche (O/N) sobre hielo húmedo en el contenedor aislado. No envíe la muestra sobre hielo seco, ya que la congelación matará las células.
>2. Preparación para el procesamiento de muestras
- Antes de comenzar la preparación de la muestra, esterilice las campanas de cultivo de tejidos junto con las hojas de afeitar, los hemostáticos curvos y cualquier otra herramienta no estéril bajo luz ultravioleta (UV) durante 1 h. Realice todos los pasos siguientes en condiciones estériles para evitar la contaminación de los cultivos.
- Preparar y esterilizar soluciones de filtro.
- Para preparar la solución de sacarosa 1,8 M, disuelva 308,07 g de sacarosa en 300 ml de agua destilada. Agregue 50 mL de solución salina tamponada de Hank's (HBSS) 10x sin calcio ni magnesio y lleve el volumen total a 500 mL usando agua destilada. Conservar a 4 °C.
- Para preparar la solución de digestión enzimática, tome 50 mL de HBSS con calcio y magnesio por cada 10 mL de tejido picado y agregue 500 μL 5 mg/mL de desoxirribonucleasa I (concentración final 50 μg/mL), 500 μL 2,5 mg/mL de colagenasa I/II y solución de dispasa (concentración final 25 μg/mL), y 500 μL 1 M tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES). Precalentar la solución de digestión en un baño de agua a 37 °C.
- Para preparar la base de medios del tallo tumoral (TSM), mezcle 250 mL de Neurobasal-A, 250 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mix F12 (DMEM/F12), 5 mL 100x antibiótico-antimicótico, 5 mL 200 mM de dipéptido L-alanil-L-glutamina (GlutaMAX-A), 5 mL de tampón HEPES, 5 mL de piruvato de sodio 100 mM y 5 mL 100x MEM aminoácidos no esenciales.
- Para preparar TSM completo con factores de crecimiento, agregue los siguientes suplementos a la base de TSM: 50x B27 Suplemento Menos Vitamina A (1:50), Factor de Crecimiento Epidérmico humano (H-EGF, 20 ng/mL), Factor de Crecimiento de Fibroblastos humanos (H-FGF, 20 ng/mL), Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humanas AA (H-PDGF-AA, 10 ng/mL), Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humanas BB (H-PDGF-BB, 10 ng/mL) y solución de heparina (2 μg/mL).
- Preenfriar una centrífuga de laboratorio equipada con un rotor de cuba oscilante a 4 °C.
3. Disociación mecánica
- Transfiera el tejido a una placa de cultivo celular de paredes altas de 100 mm x 20 mm. Retire los medios sobrantes del envío y reemplácelos con medios de cultivo en frío de 10 a 15 ml.
- Usando los hemostáticos curvos para agarrar una hoja de afeitar, pique finamente el tejido mientras elimina los vasos sanguíneos o las meninges evidentes.
nota: Los fragmentos finales de tejido deben ser menores de 1 mm (ver Figura 2B).
- Transfiera el tejido a un tubo cónico limpio de 50 ml. Lave la placa de cultivo celular con 5 ml adicionales de medio de cultivo en frío y transfiéralo al tubo cónico. Repita este paso de lavado según sea necesario para transferir el tejido restante.
- Con una pipeta serológica de 10 mL, triturar suavemente (4 - 5 veces). Permita que los fragmentos de tejido más grandes se depositen en el fondo del tubo. Si es necesario, centrifugar brevemente la muestra durante 1 min (350 x g, 4 °C).
- Recoger la fracción disociada mecánicamente.
- Retire el sobrenadante y fíltrelo a través de un filtro de 100 μm en un nuevo tubo cónico de 50 mL etiquetado como "Disociación mecánica". Invierta el filtro sobre el tubo cónico original y lave con medios de cultivo para recuperar los fragmentos de tejido.
- Centrifugar la fracción de "Disociación Mecánica" durante 5 min (350 x g, 4 °C).
- Retire el sobrenadante de la fracción de "Disociación Mecánica" peletizada y vuelva a suspender el tejido en medios de cultivo fríos. Si hay más de 5 mL de tejido en el tubo cónico de "disociación mecánica", divida el tejido en otros tubos cónicos de 50 mL de manera que ningún tubo tenga más de 5 mL de tejido.
- Almacene la fracción disociada mecánicamente en hielo hasta la etapa de centrifugación en gradiente de sacarosa (Paso 5). Alternativamente, la fracción disociada mecánicamente puede continuar con el Paso 5 durante el período de incubación por disociación enzimática (Paso 4.4).
>4. Disociación enzimática
- Si hay más de 5 mL de tejido en el tubo que contiene los fragmentos de tejido más grandes restantes, divida el tejido en otros tubos cónicos nuevos de 50 mL de modo que ningún tubo tenga más de 5 mL de tejido.
- Centrifugar el tubo o tubos cónicos que contienen los fragmentos de tejido restantes durante 5 min (350 x g, 4 °C).
- Retire el sobrenadante y agregue la solución de digestión enzimática precalentada, de modo que haya 5 mL de solución de digestión por cada 1 mL de tejido (por ejemplo, 25 mL de solución de digestión para 5 mL de tejido).
- Selle las tapas de los tubos cónicos con film de laboratorio e incube la reacción en un rotador a 37 °C durante 30 min.
- Después de la incubación, triture las muestras suavemente (consulte la Figura 2C).
- Con una pipeta serológica de 10 ml, pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo de 6 a 8 veces. Evite generar burbujas de aire excesivas.
- Añada una punta de pipeta de 1.000 μL al extremo de la pipeta y triture de 6 a 8 veces más.
- Deje que los trozos restantes se asienten en el fondo del tubo. Retire y filtre el sobrenadante con las células aún suspendidas a través de un filtro de 100 μm en un nuevo tubo cónico de 50 ml etiquetado como "Disociación enzimática" y almacene en hielo.
- Si quedan fragmentos significativos de tejido, añadir 10 mL adicionales de HBSS con calcio y magnesio a los fragmentos y repetir los pasos 3.5.1 y 3.5.2. Filtre esta solución final a través de un filtro de 100 μm en el tubo de "disociación enzimática".
- Centrifugar el tubo de "disociación enzimática" durante 5 min (350 x g, 4 °C) y continuar con la centrifugación en gradiente de sacarosa.
5. Centrifugación en gradiente de sacarosa
- Si las muestras aún están suspendidas en solución, centrifugar durante 5 min (350 x g, 4 °C).
- Retirar el sobrenadante y resuspender el tejido en 20 mL de HBSS frío sin calcio ni magnesio. Aumente el volumen hasta 25 ml en total con HBSS frío.
- Agregue lentamente 25 mL de solución de sacarosa 1.8 M e invierta el tubo para mezclar. Esto da como resultado un gradiente de sacarosa de 0,9 M.
- Centrífuga sin freno durante 10 min (800 x g, 4 °C). El uso de un freno de centrifugación interrumpirá el gradiente y reducirá el rendimiento (consulte la Figura 2D para ver un ejemplo de una muestra antes y después de la centrifugación).
- Aspire cuidadosamente los restos de mielina y la mayor cantidad posible de solución de sacarosa. Lave la muestra añadiendo 30 mL de HBSS frío sin calcio ni magnesio y mezcle suavemente. Centrifugar durante 5 min (350 x g, 4 °C).
>6. Lisis de glóbulos rojos ACK
- Retire el sobrenadante de lavado. Agregue 5 ml de tampón de lisis ACK y vuelva a suspender suavemente el pellet de celda, girando el tubo durante 1 minuto en RT.
- Apague la lisis añadiendo 30 mL de HBSS frío sin calcio ni magnesio.
- Centrifugar durante 5 min (350 x g, 4 °C).
>7. Mantenimiento inicial de la cultura
- Vuelva a suspender los gránulos celulares finales en 10 - 15 mL de TSM completo tibio con factores de crecimiento y cuantifique la densidad celular viable en un hemocitómetro utilizando exclusión de azul de tripán.
nota: El rango de células viables varía ampliamente dependiendo de las circunstancias de la donación de tejido, y la cuantificación puede ser difícil en esta etapa temprana debido a los restos celulares sobrantes. En un caso ideal, trate de tener un millón de células vivas por muestra. En los casos en que queden residuos excesivos, se coloque a una densidad más baja en un matraz T175.
- Transfiera las suspensiones celulares finales a un nuevo matraz de cultivo T75. Aumentar los factores de crecimiento adicionales cada dos días para mantener los niveles generales de factores de crecimiento y monitorear el desarrollo de las neuroesferas de las células tumorales (ver Figura 2E y Figura 3).
