Diferenciación de células progenitoras neurales de la médula espinal en neuronas motoras

Resumen

Fuente: Taga, A. et al., Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para el modelado de ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas a nivel regional. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra un método para diferenciar las células progenitoras neurales (NPC) de la médula espinal en neuronas motoras. En él se detalla el proceso de cultivo de las NPC en una placa de cultivo recubierta utilizando medios especializados enriquecidos con inhibidores específicos destinados a facilitar la diferenciación de las NPC en neuronas motoras maduras.

Protocolo

>1. Descongelación de cultivos de células progenitoras neurales (NPC)

1. Cubrir las placas de 10 cm con poliornitina (PLO) y laminina el día antes de descongelar las células.
   1. Añadir 5 mL de PLO diluido a 100 μg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o agua destilada (_dH2O) a las placas. Incubar a 37 °C durante un mínimo de 1 h hasta toda la noche.
   2. Aspire la solución de PLO y enjuague las placas tres veces con PBS. (El PLO es tóxico si no se lava adecuadamente).
   3. Añada laminina diluida en PBS a una concentración de 10 μg/mL a las placas recubiertas de PLO. Incubar a 37 °C durante un mínimo de 1 h, preferiblemente durante la noche. Después de la incubación, aspire la solución de laminina sin enjuagar para mejorar la adhesión celular.
      nota: Las placas se pueden recubrir con PLO con anticipación, lavarse tres veces con agua, secar en una campana estéril y almacenar a 4 °C.
2. Descongele un vial de NPC que contenga 6 x 10⁶ células/vial por cada placa de cultivo celular de 10 cm.
3. Retire el tubo criogénico NPC del nitrógeno líquido y colóquelo inmediatamente en un baño de agua a 37 °C durante un máximo de 2 minutos. Descongele rápidamente agitando el vial hasta que quede un pequeño trozo de hielo rodeado de líquido.
4. Transfiera los agregados celulares a un tubo cónico de 15 mL utilizando una pipeta de 1000 μL y agregue hasta 15 mL de medio de diferenciación neural (NDM) precalentado o medio de águilas modificado de Dulbecco (DMEM) / suplemento F21 F12 de Ham para diluir el dimetilsulfóxido (DMSO).
5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min.
6. Aspirar el sobrenadante, resuspender el pellet celular con medio de diferenciación de neurona motora (MN) (Tabla 1) + ROCK-I (20 μM), y utilizar una pipeta de 1000 μL para triturar hacia arriba y hacia abajo hasta obtener una suspensión de una sola célula (hasta 5 veces).
7. Transfiera la suspensión de una sola celda a una placa de 10 cm recubierta de PLO-Laminin.
8. Transfiera la placa a una incubadora y déjela sin tocar durante la noche para permitir una adhesión celular adecuada

>2. Diferenciación de NPC de la médula espinal en neuronas motoras

1. Realice los pasos iniciales como se menciona en los pasos 1.1-1.8, siendo el medio final el medio de diferenciación MN + ROCK-I (20 μM).
2. El día después del recubrimiento, realice un intercambio completo del medio con el medio de diferenciación MN sin ROCK-I, y luego cambie el medio cada dos días. Durante el fin de semana, alimente las células el viernes y luego nuevamente el lunes. Enjuague las celdas con PBS cuando sea necesario para eliminar los desechos celulares.
3. Cambie el medio con medio de diferenciación MN + arabinósido de citosina (ARA-C) (0,02 μM) e incube durante 48 h cuando los progenitores comprometidos gliales emerjan como células planas proliferantes individuales bajo progenitores MN postmitóticos agregados en grupos de células
   nota: Por lo general, esto ocurre dentro de los primeros 7 días después de la siembra inicial, aunque puede haber variabilidad según la línea celular.
4. Después de 48 h, aspire el medio que contiene ARA-C, enjuague los cultivos suavemente con PBS tres veces y cambie el medio a medio MN fresco sin ARA-C.
5. Después del tratamiento con ARA-C, realice intercambios de medio cada dos días (o lunes, miércoles y viernes) eliminando el medio antiguo con una pipeta manual en lugar de un aspirador de vacío para evitar el desprendimiento prematuro de los grupos neuronales. Además, enriquezca el medio MN con laminina 1 μg/mL una vez a la semana para mejorar aún más la unión neuronal a las placas de cultivo.

Tabla 1: Medios de cultura

Nombre del medio	Reactivos	Concentraciones
Medio de diferenciación neuronal (NDM)	Neurobasal L-Glutamina Aminoácidos no esenciales Suplemento N - N2 Suplemento Penicilina/estreptomicina	1x 100x 100x 100x 100 veces
Medio de diferenciación de neuronas motoras	Medio de diferenciación neuronal Ácido ascórbico Puromorfamina Factor neurotrófico derivado del cerebro Factor neurotrófico ciliar Factor de crecimiento similar a la insulina 1 Factor neurotrófico derivado de línea celular glial Ácido retinoico Compuesto E Suplemento B - B27 Suplemento	1x 0,4 μg/mL 1 μM 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1 μM 125 nM 50 veces

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo estériles de 10 cm	halcón	353003
Aminoácidos no esenciales (NEAA)	Termopescador	11140050	Concentración de trabajo 100x
Suplemento N - Suplemento N2	Termopescador	17502048	Concentración de trabajo 100x
L-Glutamina	Termopescador	25030	Concentración de trabajo 100x
Neurobasal	Termopescador	21103049	Concentración de trabajo 1x
Ácido retinoico (AR)	sigma	R2625	Disuelva 100 mg en 3,3 mL de DMSO para obtener 100 mM de solución madre. Alícuota el caldo 100 μL/tubo y congelar a -80 ºC. Tome 200 μL de caldo de 100 mM y diluya 10x (agregue 1,8 mL de DMSO) para hacer 10 mM de caldo. Alícuota 50 μL/tubo y conservar a -80 ºC. Diluir a 1:10000 para su uso. (concentración de trabajo 2 μM).
Poliornitina (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Disuelva 100 mg en 1 mL de ddW para obtener 100 mg/mL de solución madre. Alícuota el stock en tubos de 100 μL. (concentración de trabajo 100 μg/mL)
Laminina	Termopescador	23017-015	Solución madre 1 mg/mL, concentración de trabajo 10 μg/mL (recubrimiento), 1 μg/mL (medio celular)
Ácido ascórbico (ASAC)	sigma	A4403	Disuelva 100 mg en 250 ml de dH2O para obtener un caldo de 0,4 mg/ml. Filtro estéril a través de un filtro de 0,22 μm, alícuota y congelación a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 0,4 μg/mL).
Factor neurotrófico ciliar (CNTF)	Peprotech	450-13	Disuelva 100 μg en 1 ml de PBS estéril y, a continuación, añada 9 ml de BSA-PBS estéril al 0,1 % a 10 μg/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Compuesto E	Abcam	AB142164	Disuelva 250 μg en 2,0387 mL de DMSO para obtener un caldo de 250 μM. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir 1:2000 para su uso. (concentración de trabajo 125 nM).
DMEM/F12	Termopescador	113300	Concentración de trabajo 1x
Neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF)	Peprotech	450-10	Disuelva 100 μg en 1 mL de PBS a 100 μg/mL, y luego agregue 9 mL de BSA-PBS estéril al 0,1% a 10 μg/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Nhibitor ROCK-I	Peprotech	1293823	Disolver 5 mg en 1480 μL de dH2O para obtener 10 mM de caldo, alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:500 para su uso. (concentración de trabajo 20 μM).
Pencillin/Estreptomicina	Termopescador	15140122	Concentración de trabajo 100x
Purmorfamina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Disuelva 5 mg en 9,6 mL de DMSO para obtener una solución de 1 mM. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 1 μM).
Factor neurotrófico recombinante derivado del cerebro humano (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifugar brevemente antes de la reconstitución. Disuelva 100 μg en 1 mL de PBS a 100 μg/mL, y luego agregue 9 mL de BSA-PBS estéril al 0,1% a 10 μg/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1)	Sistemas de investigación y desarrollo	291-G1-200	Disolver 200 μg en 2 mL de PBS a 100 μg/mL, luego agregar 18 mL de 0.1%BSA-PBS para hacer 10 μg/mL de caldo y almacenar a -80 ºC. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir 10 μg/mL de caldo a 1: 1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF)	Peprotech	450-10	Disuelva 100 μg en 1 mL de PBS a 100 μg/mL, y luego agregue 9 mL de BSA-PBS estéril al 0,1% a 10 μg/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Ácido retinoico (AR)	sigma	R2625	Disuelva 100 mg en 3,3 mL de DMSO para obtener 100 mM de solución madre. Alícuota el caldo 100 μL/tubo y congelar a -80 ºC. Tome 200 μL de caldo de 100 mM y diluya 10x (agregue 1,8 mL de DMSO) para hacer 10 mM de caldo. Alícuota 50 μL/tubo y conservar a -80 ºC. Diluir a 1:10000 para su uso. (concentración de trabajo 2 μM).
Compuesto E	Abcam	AB142164	Disuelva 250 μg en 2,0387 mL de DMSO para obtener un caldo de 250 μM. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir 1:2000 para su uso. (concentración de trabajo 125 nM).
Suplemento B - B27 Suplemento	Termopescador	21985023	Concentración de trabajo 50x
Campanas de cultivo celular estériles	Compañía Panadera	SG-600
Centrífuga de cultivo celular de mesa	ThermoFisher	75004261	Leyenda de Sorvall X1R
Baño de agua	ThermoFisher	Artículo 2332	Isotemp
Incubadora de cultivo celular con control de humedad	ThermoFisher	370	ajustado a 37 ºC, 5 % CO2