Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparativos
- Preparativos para el aislamiento de CGNP (progenitor de neuronas granulares cerebelosas)
- Organizar un apareamiento adecuado de ratones para generar animales P5-P7 para aislar el cerebelo (3-5 animales por ChIP y condición).
- Prepare HBSS/glucosa añadiendo 6 mg/mL de glucosa al tampón HBSS.
- Prepare el medio de cultivo celular (MCG) de CGNP añadiendo un suplemento de N2 al 1 % (v/v), un 1 % (v/v) de penicilina-estreptomicina-neomicina, 25 mM de KCl y FCS al 10 % al DMEM-F12. Para el cultivo de CGNP, prepare un medio CGM sin FCS pero que incluya 0,6 μg/mL de erizo sónico (SHH) (CGM-SHH) y equilibre a 37 °C cuando sea necesario.
- Cubra las placas de cultivo celular de 6 pocillos con 100 μg/mL de poli-D-lisina durante 1-2 h en RT para la eliminación de las células gliales. A continuación, lavar dos veces con ddH2O estéril y dejar secar las placas. Almacene las placas durante un máximo de una semana a 4 °C.
- Para el cultivo de CGNPs, recubra las placas de cultivo celular de 6 pocillos con poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 °C durante la noche. A continuación, lavar dos veces con H2O para el cultivo celular y dejar secar las placas.
nota: Las placas se pueden almacenar durante un máximo de una semana a 4 °C.
- Preparar tripsina al 0,025 % (p/v) en HBSS/glucosa y equilibrarlo a 37 °C cuando sea necesario.
- Aislamiento de progenitores neurales del tejido cerebral
- Aislamiento y cultivo opcional de CGNPs (progenitores de neuronas granulares cerebelosas)
- Sacrificar a los animales P5-7 por decapitación con tijeras. Retire la piel del cuero cabelludo, abra el cráneo y extraiga el cerebro con tijeras y pinzas pequeñas. Aísle el cerebelo y transfiéralo a HBSS/glucosa helada. Retire todas las meninges y vasos sanguíneos y transfiera la cerebela a tubos de 15 ml llenos de HBSS/glucosa fría.
- Lavar la cerebela tres veces con 10 mL de HBSS/Glucosa helada (recogerlas por centrifugación a 650 x g durante 5 min a 4 °C) y homogeneizar la cerebela posteriormente pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL (máximo 2-3 veces) para obtener fragmentos de 0,5-1 mm3.
- Añadir 5 mL de tripsina al 0,025% en HBSS/Glucosa e incubar el tejido bajo agitación constante en un baño de agua a 37 °C durante 15 min. Detener la digestión añadiendo 5 mL de MCG y recoger el tejido por centrifugación a 650 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y triture el tejido con una punta de pipeta de 1 mL en un MCG de 1 mL y transfiéralo a un nuevo tubo de 15 mL.
nota: Es importante evitar las burbujas de aire.
- Agregue 5 ml de MCG e incube la mezcla durante 2 minutos en hielo para asentar los restos de tejido. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mL. Agregue 2 ml de MCG al tejido residual y repita el procedimiento de trituración.
- Agrupar los sobrenadantes (sin restos de tejido, unos 10 mL en total) y centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 °C para recoger las células cerebelosas. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de MCG.
- Dado que los astrocitos se adhieren más rápido y con más fuerza a la poli-D-lisina que a los CGNP, coloque las células en placas de 6 pocillos recubiertas de poli-D-lisina de 100 μg/mL (hasta 4 mL por pocillo) e incube durante 20 minutos a 37 °C para eliminar los astrocitos.
- Agite el plato y recoja el sobrenadante. A continuación, centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 °C en un tubo de 15 mL. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de MCG y cuente las células con una cámara de recuento de Neubauer.
nota: Los CGNP son redondos, pequeños y muestran un halo cuando se obtienen imágenes con microscopía de contraste de fase.
- Si es necesario, siembre las células en MCG precalentado a 37 °C en placas recubiertas de poli-L-ornitina (3 x 106 celdas por 6 pocillos) e incube a 37 °C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa.
nota: Dejar CGM en las placas (y con ello FBS) dará como resultado la diferenciación de las CGNP en neuronas granulares cerebelosas (CGN).
