Aislamiento y cultivo de progenitores granulares de neuronas cerebelosas murinas

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparativos

1. Preparativos para el aislamiento de CGNP (progenitor de neuronas granulares cerebelosas)
   1. Organizar un apareamiento adecuado de ratones para generar animales P5-P7 para aislar el cerebelo (3-5 animales por ChIP y condición).
   2. Prepare HBSS/glucosa añadiendo 6 mg/mL de glucosa al tampón HBSS.
   3. Prepare el medio de cultivo celular (MCG) de CGNP añadiendo un suplemento de N2 al 1 % (v/v), un 1 % (v/v) de penicilina-estreptomicina-neomicina, 25 mM de KCl y FCS al 10 % al DMEM-F12. Para el cultivo de CGNP, prepare un medio CGM sin FCS pero que incluya 0,6 μg/mL de erizo sónico (SHH) (CGM-SHH) y equilibre a 37 °C cuando sea necesario.
   4. Cubra las placas de cultivo celular de 6 pocillos con 100 μg/mL de poli-D-lisina durante 1-2 h en RT para la eliminación de las células gliales. A continuación, lavar dos veces con ddH₂O estéril y dejar secar las placas. Almacene las placas durante un máximo de una semana a 4 °C.
   5. Para el cultivo de CGNPs, recubra las placas de cultivo celular de 6 pocillos con poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 °C durante la noche. A continuación, lavar dos veces con H₂O para el cultivo celular y dejar secar las placas.
      nota: Las placas se pueden almacenar durante un máximo de una semana a 4 °C.
   6. Preparar tripsina al 0,025 % (p/v) en HBSS/glucosa y equilibrarlo a 37 °C cuando sea necesario.
2. Aislamiento de progenitores neurales del tejido cerebral
   1. Aislamiento y cultivo opcional de CGNPs (progenitores de neuronas granulares cerebelosas)
      1. Sacrificar a los animales P5-7 por decapitación con tijeras. Retire la piel del cuero cabelludo, abra el cráneo y extraiga el cerebro con tijeras y pinzas pequeñas. Aísle el cerebelo y transfiéralo a HBSS/glucosa helada. Retire todas las meninges y vasos sanguíneos y transfiera la cerebela a tubos de 15 ml llenos de HBSS/glucosa fría.
      2. Lavar la cerebela tres veces con 10 mL de HBSS/Glucosa helada (recogerlas por centrifugación a 650 x g durante 5 min a 4 °C) y homogeneizar la cerebela posteriormente pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL (máximo 2-3 veces) para obtener fragmentos de 0,5-1 mm³.
      3. Añadir 5 mL de tripsina al 0,025% en HBSS/Glucosa e incubar el tejido bajo agitación constante en un baño de agua a 37 °C durante 15 min. Detener la digestión añadiendo 5 mL de MCG y recoger el tejido por centrifugación a 650 x g durante 5 min a 4 °C.
      4. Retire el sobrenadante y triture el tejido con una punta de pipeta de 1 mL en un MCG de 1 mL y transfiéralo a un nuevo tubo de 15 mL.
         nota: Es importante evitar las burbujas de aire.
         1. Agregue 5 ml de MCG e incube la mezcla durante 2 minutos en hielo para asentar los restos de tejido. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mL. Agregue 2 ml de MCG al tejido residual y repita el procedimiento de trituración.
      5. Agrupar los sobrenadantes (sin restos de tejido, unos 10 mL en total) y centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 °C para recoger las células cerebelosas. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de MCG.
      6. Dado que los astrocitos se adhieren más rápido y con más fuerza a la poli-D-lisina que a los CGNP, coloque las células en placas de 6 pocillos recubiertas de poli-D-lisina de 100 μg/mL (hasta 4 mL por pocillo) e incube durante 20 minutos a 37 °C para eliminar los astrocitos.
      7. Agite el plato y recoja el sobrenadante. A continuación, centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 °C en un tubo de 15 mL. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de MCG y cuente las células con una cámara de recuento de Neubauer.
         nota: Los CGNP son redondos, pequeños y muestran un halo cuando se obtienen imágenes con microscopía de contraste de fase.
      8. Si es necesario, siembre las células en MCG precalentado a 37 °C en placas recubiertas de poli-L-ornitina (3 x 10⁶ celdas por 6 pocillos) e incube a 37 °C, 5% de CO₂ y 100% de humedad relativa.
         nota: Dejar CGM en las placas (y con ello FBS) dará como resultado la diferenciación de las CGNP en neuronas granulares cerebelosas (CGN).