1. Generación de organoides cerebrales corticales (Figura 1)
NOTA: Todos los pasos de esta sección del protocolo se llevarán a cabo en una campana de bioseguridad de Clase 2 a menos que se indique lo contrario.
- Inducción de colonias neuroectodérmicas 2D a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) Cultivo 2D (Días -1 a 3)
- Antes de la inducción, coloque las colonias de hPSC en una matriz de membrana basal calificada para células madre embrionarias humanas (hESC) en una placa de 6 pocillos con una densidad del 20% al 30%. Logre esta densidad haciendo pasar las colonias de hPSC de un pocillo de una placa de 6 pocillos con una confluencia del 60% a tres pocillos de una placa de 6 pocillos.
- Para el recubrimiento de la matriz de la membrana basal, diluya la matriz de la membrana basal en una proporción de 1:50 en un medio basal simple. Deposite uniformemente 1 mL/pocillo de una placa de 6 pocillos, incube durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) y luego aspire.
- Mantener las colonias de hPSC durante 1 día en 2 mL de un medio de cultivo celular libre de suero antes de la diferenciación.
- El día de la diferenciación de hPSC, inspeccione las colonias de hPSC utilizando microscopía de campo claro con un aumento de 4x a 10x para garantizar colonias sanas sin diferenciación detectable><.
nota: Las hPSC sanas formarán colonias de borde apretado con células que tienen un núcleo grande, citoplasma muy pequeño y nucléolos prominentes. Las colonias de iPSC diferenciadas exhibirán claras diferencias morfológicas con respecto a las colonias de hPSC descritas anteriormente, particularmente alrededor de los bordes exteriores de las colonias o en el centro.
- Agregue los reactivos enumerados en la Tabla 1 para formar el medio N2 requerido para la diferenciación. Lleve este medio a RT antes de usarlo.
- Una vez en RT, aspire el medio de cultivo celular sin suero de cada pocillo de la placa de 6 pocillos y reemplácelo con 2 mL de medio N2 adicionado suavemente con una pipeta serológica de 5 mL.
- Añadir el supresor dual de madres contra los inhibidores decapentopléjicos (SMAD), SB-431542 (10 μM) y LDN 193189 (100 nM)
nota: Los inhibidores de SMAD se pueden agregar al medio N2 después de que el medio se haya colocado en cada pocillo o a la cantidad requerida de medio N2 antes de reemplazar el medio de cultivo celular libre de suero. Los inhibidores se pueden incorporar uniformemente en el medio girando suavemente la placa o invirtiendo el tubo que contiene el medio y los inhibidores 3-4 veces.
- Agregue medios de N2 frescos suplementados con SB-431542 (10 μM) y LDN 193189 (100 nM) diariamente a cada pocillo durante los próximos 2 días.
nota: Se agrega medio N2 fresco para reducir la exposición prolongada de las células al dimetilsulfóxido (DMSO) que se utiliza para disolver los compuestos SB-431542 y LDN 193189 y prevenir la citotoxicidad.
- Generación de esferoides neuroectodérmicos 3D a partir de colonias neuroectodérmicas 2D inducidas (Días 3 a 7)
- Levantar las colonias neuroectodérmicas inducidas utilizando dispasa siguiendo los pasos 1.2.2-1.2.8.
- Primero, retire 2 ml de medio N2 de la placa de 6 pocillos y lave 1 vez con HBSS para asegurarse de que se elimine todo el medio N2><.
nota: El medio N2 puede interferir con la actividad enzimática de la dispasa, impidiendo el desprendimiento adecuado de las colonias neuroectodérmicas del pozo.
- Agregue 1 mL de 2.4 unidad/mL de dispasa a cada pocillo que contenga colonias.
- Incubar el pocillo durante 20-25 min (máximo 30 min) a 37 °C. Compruebe regularmente si hay desprendimiento de colonias.
nota: Las colonias pequeñas pueden desprenderse en 20 minutos. Cualquier colonia que permanezca atascada después de 30 minutos debe ser ignorada.
- Después de la incubación, agregue 1 mL de medio N2 al pocillo para detener la actividad de la enzima dispasa y transfiera las colonias a un tubo de 15 mL usando una punta de pipeta P1000 de diámetro ancho o una punta de pipeta P1000 modificada cortada con tijeras estériles (convirtiéndola en una punta P1000 de diámetro ancho).
- Permita que los grupos de colonias se hundan hasta el fondo del tubo con la gravedad.
nota: Este proceso tardará aproximadamente 1 minuto.
- Una vez que los grumos se hayan hundido, retire con cuidado el sobrenadante con una punta de pipeta P1000 estándar y reemplácelo con 1 mL de medio N2 fresco. Repita este paso de lavado tres veces para asegurar la eliminación completa de la dispasa.
nota: Cualquier dispasa remanente evitará una formación uniforme de esferoides neuroectodérmicos e inducirá la muerte celular.
- Después del lavado, vuelva a suspender los grupos de células en 3 mL de medio N2, transfiéralo a un pocillo de una placa de 6 pocillos y agregue 40 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF).
nota: Si se desprendiera un gran número de colonias neuroectodérmicas, estas colonias podrían colocarse en dos o más pocillos de una placa de 6 pocillos para evitar la fusión de esferoides. 24 h después del desprendimiento de las colonias, comprobar si se han formado los esferoides.
- Mantenga los esferoides en el mismo medio durante los próximos 3-4 días, pero agregue bFGF fresco (40 ng/mL) a cada pocillo diariamente para promover la proliferación de células neuroectodérmicas, autoorganizadas, e inducir y expandir el neuroepitelio><.
nota: Si los esferoides se han sembrado a una densidad más alta, es probable que el medio se vuelva amarillo y requiera ser reemplazado cada 2 días con bFGF fresco (40 ng/mL). Sin embargo, esto no se recomienda y, en cambio, se debe mantener un número menor de esferoides en cada pozo para evitar este problema. Los esferoides pueden incrustarse en la matriz de la membrana basal después de 3 días si los neuroepitelios son evidentes. Si los neuroepitelios no son evidentes o no se ven fuertes, mantenga los esferoides para otro día y vuelva a revisar.
Tabla 1: N2 Medio. La tabla enumera los reactivos necesarios para preparar el medio N2.
| Componentes de medios | concentración |
| DMEM Mezcla de nutrientes F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | |
| Suplemento N2 5 mL (100x) | Supplmentado al 1% |
| B 27 Suplemento 10 mL | Suplementado al 2% |
| MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x) | Suplementado al 1% |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) | Suplementado al 1% |
| 2-Mercaptoetanol 50 mL (1000x ) | Suplementado al 0,1% |
