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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de material de disección, medios de cultivo, dispositivos microfluídicos
- Pinzas de microdisección y tijeras de autoclave (121 °C, tiempo de esterilización: 20 min) y guárdelas en un recipiente estéril.
- Esterilizar los cubreobjetos de vidrio (24 mm x 24 mm) incubándolos en HCl 1 M durante 24 horas en un agitador orbital a 37 °C. Lavarlos tres veces con H2O estéril destilado y tres veces con etanol al 99 %. A continuación, seque los cubreobjetos a 37 °C o bajo una campana de flujo estéril. Por último, esterilizar en autoclave o exponer los cubreobjetos a la luz ultravioleta (30 min) para completar la esterilización. A continuación, los cubreobjetos se pueden almacenar en etanol al 70%.
- Con pinzas estériles, retire con cuidado los dispositivos de aislamiento de axones AXIS del paquete y colóquelos en una placa de Petri estéril.
- Utilizando un punzón de biopsia estéril (ø: 1 mm), cree un orificio por muestra a cultivar (Figura 1) en correspondencia con las cámaras de cultivo.
nota: No perfore demasiado cerca de las microranuras, ya que pueden dañarse con la presión aplicada.
- Esterilice los dispositivos de aislamiento de axones AXIS sumergiéndolos en etanol al 70 %. A continuación, seque completamente los dispositivos de aislamiento AXIS Axon y los cubreobjetos bajo una campana de flujo estéril. Espere un mínimo de 3 horas antes de continuar.
nota: El secado incompleto dará lugar a un montaje defectuoso de los dispositivos microfluídicos.
- Coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 35 mm o en un pocillo dentro de una placa de 6 pocillos.
- Coloque el dispositivo de aislamiento AXIS Axon en el cubreobjetos y presione suave pero firmemente con pinzas con los extremos doblados para permitir la adhesión total entre el dispositivo de aislamiento y el cubreobjetos de vidrio.
- En cada cámara de cultivo, pipetear 150 μl de poli-D-lisina (0,1 mg/ml en H2O estéril destilado). Coloque los dispositivos microfluídicos al vacío durante 5 minutos, para eliminar todo el aire de las cámaras de cultivo.
- Si todavía se puede ver aire dentro de las cámaras, vuelva a pipetear la solución de poli-D-lisina en las cámaras.
- Incubar los dispositivos con poli-D-lisina O/N a 37 °C.
- Lave las cámaras tres veces con H2O estéril y destilado.
- Llene las cámaras con 150 μl de solución de trabajo de laminina (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o en medio libre de suero) e incube O/N a 37 °C.
- Preparar 50 ml de medio para cultivos de ganglios trigéminos con la siguiente composición: 48 ml de medio neurobasal, 1 ml de B-27, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 5 ng/ml de factor de crecimiento nervioso (NGF), 0,25 pM de arabinósido de citosina.
- Preparar 50 ml de medio para cultivos de gérmenes dentales con la siguiente composición: 40 ml de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)-F12, 10 ml de suero fetal bovino (FBS, concentración final: 20%), 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 150 μg/ml de ácido ascórbico.
>2. Generación y disección de embriones de ratón
- Determinar la edad embrionaria a partir del tapón vaginal (tapón vaginal: día de desarrollo embrionario 0,5, E0,5) y confirmarla mediante criterios morfológicos. Para este protocolo, generalmente utilizamos embriones de ratón E14.5-E17.5.
- Limpie el área de disección y el estereoscopio con etanol al 70%.
- Sacrificar a la madre embarazada por luxación cervical. Coloque el cuello del ratón entre el primer y el segundo dedo en una cuadrícula y tire de la cola con decisión.
- Disecciona la piel alrededor de la parte inferior del abdomen y abre el abdomen con unas tijeras. Localizar el útero: durante las últimas etapas del embarazo, el útero llena abundantemente la cavidad abdominal.
- Disecciona el útero y colócalo en un tubo lleno de PBS en hielo. Cuando está en hielo, el tejido se puede dejar durante varias horas. Desechar el cadáver de la madre de acuerdo a los lineamientos institucionales.
- Diseccionar los embriones del útero y liberarlos de sus tejidos extraembrionarios. Coloque los embriones en PBS sobre hielo.
- Decapitar los embriones con unas tijeras y separar el maxilar inferior del resto de la cabeza con unas tijeras de microdisección (Figura 2A). Retire la mandíbula inferior con precisión, sin dañar los ganglios del trigémino; Como estos últimos se localizan muy cerca de la mandíbula inferior, es posible que se produzcan daños accidentales. Conservar la mandíbula inferior y el resto de la cabeza en PBS frío, sobre hielo.
- Para diseccionar los ganglios del trigémino (TG), tome la cabeza y colóquela en una placa de Petri de vidrio para disección, previamente llena de PBS frío. Con las pinzas, retire la piel y el cráneo. A continuación, retire el telencéfalo y el cerebelo colocando pinzas por debajo del telencéfalo y levante; El telencéfalo y el cerebelo se voltearán juntos, dejando expuesta la parte inferior del cráneo.
- Localizar los ganglios del trigémino (Figura 2B). Use fórceps para separar el TG de los nervios trigéminos. Eliminar los restos de las proyecciones del trigémino utilizando las agujas de disección como cuchillos. Coloque el TG diseccionado en una placa de Petri llena de PBS frío y manténgalos en hielo.
- Para diseccionar los dientes embrionarios, coloque la mandíbula inferior, previamente separada del cráneo, en la placa de Petri de vidrio de disección, llena de PBS frío. Usando agujas de disección como cuchillos, retire la lengua y la piel que rodea la mandíbula. Separe las hemimandíbulas izquierda y derecha cortando a lo largo de la línea media de la mandíbula. Los gérmenes dentales son fácilmente visibles, como se muestra en la Figura 2C. Aísle los gérmenes dentales con agujas de disección y elimine el exceso de tejidos no dentales. Coloque los gérmenes dentales disecados en una placa de Petri llena de PBS frío y manténgalos en hielo.
>3. Cocultivos microfluídicos
- Después de la disección, retire la laminina de los dispositivos microfluídicos. Llene las cámaras con 200 μl del medio correspondiente.
- Con pinzas, transfiera suavemente el TG disecado y los gérmenes dentales a los orificios creados por punzonado (Figura 2D). Asegúrese de que los gérmenes de los dientes no floten y que se hundan hasta que entren en contacto con los cubreobjetos.
- Cultivar las muestras en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2.
- Cambiar el medio de cultivo cada 48 hr. No vacíe completamente las cámaras y no pipetee directamente en las cámaras de cultivo.
El vaciado completo de las cámaras daría lugar a la formación de burbujas de aire dentro de las cámaras; El pipeteo directo en la cámara provocaría daño axonal. Para evitar estos problemas, retire el medio que apunta la pipeta hacia el lado externo de los pocillos; Del mismo modo, pipetee el medio fresco en el lado de los pocillos ubicados frente a las cámaras.
- Los cocultivos se pueden visualizar fácilmente mediante microscopía de lapso de tiempo durante el período de cultivo y se pueden mantener durante más de 10 días.
- Después del período de cultivo, lave las cámaras pipeteando 150 μl de PBS en un pocillo por cámara y deje que PBS fluya a través de las cámaras tres veces.
- Retirar el PBS y fijar las muestras pipeteando 150 μl de paraformaldehído al 4% (en PBS) en un pocillo por cámara; incubar a RT durante 15 min. Lavar las cámaras dos veces con PBS como se describe en el punto 3.6.
- Proceda con un análisis más detallado.
