$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
NOTA: La Figura 1A, B muestra un esquema del chip de copolímero de olefina cíclica (COC) preensamblado, incluidas las ubicaciones de los canales o compartimentos principales, pozos y microranuras. El chip compartimentado puede establecer distintos microambientes fluídicos dentro de un compartimento, como lo demuestra el aislamiento del colorante alimentario (Figura 1C).
1. Recubrimiento de chips multicompartimento para neuronas hSC
NOTA: La Figura 2A muestra una descripción general de los procedimientos de recubrimiento.
- Disuelva la poli-L-ornitina en agua destilada de grado de cultivo celular para hacer 600 μL de solución por chip de una solución de trabajo de 20 μg/mL.
- Aspire la solución salina tamponada con fosfato (PBS) restante después de preparar las virutas de los pozos. Al aspirar, asegúrese de que la punta de la pipeta esté alejada de la abertura del canal.
nota: Los canales microfluídicos deben permanecer llenos durante la totalidad de este procedimiento. No aspire líquido de los canales/compartimentos, solo de los pozos.
- Cargue 150 μL de solución de trabajo de poli-L-ornitina en el pocillo superior derecho. Espere 90 segundos o hasta que el líquido comience a llenar el pozo inferior derecho. Agregue 150 μL de medio en el pocillo inferior derecho y espere 5 minutos para que el líquido pase a través de las microranuras.
- Agregue 150 μL de medio en el pocillo superior izquierdo. Espere 90 s y luego agregue 150 μL al pocillo inferior izquierdo. Envuelva el soporte de los chips con parafilm y colóquelo a 4 °C durante la noche.
nota: Alternativamente, coloque el chip y el soporte a 37 °C durante 1 h.
- Aspire los medios de los pocillos, asegurándose de que la punta de la pipeta esté colocada lejos de la abertura del canal. Añadir 150 μL de agua estéril en el pocillo superior derecho. Espere 90 s y luego agregue 150 μL al pocillo inferior derecho. Espere 5 minutos para que el líquido pase a través de las microranuras.
- Agregue 150 μL de agua estéril al pocillo superior izquierdo, espere 90 s y luego agregue otros 150 μL al pocillo inferior izquierdo.
- Repita los pasos 1.5-1.6.
- Descongele la laminina lentamente a 2 °C a 8 °C y prepare una solución de trabajo de 10 μg/mL.
- Cargue 150 μL de la solución de trabajo de laminina en el pocillo superior derecho. Espere 90 segundos o hasta que el líquido comience a llenar el pozo inferior derecho. Pipetear 150 μL en el pocillo inferior derecho. Espere 5 minutos para que la laminina pase a través de las microranuras.
- Añadir 150 μL de laminina en el pocillo superior izquierdo. Espere 90 s y luego agregue 150 μL al pocillo inferior izquierdo. Incubar el chip dentro de su soporte durante 2 h a 37 °C.
- Enjuague el chip con PBS (sin Ca2+ y Mg2+). Cargue 150 μL de PBS en el pocillo superior derecho. Espere 90 segundos o hasta que el líquido comience a llenar el pozo inferior derecho. Agregue 150 μL de PBS en el pocillo inferior derecho y espere 5 minutos para que el PBS pase a través de las microranuras.
- Pipetear 150 μL de PBS en el pocillo superior izquierdo. Después de 90 s, pipetear 150 μL hasta el pocillo inferior izquierdo.
- Aspire el PBS del chip y, a continuación, enjuague el chip con medios NSC (consulte la Tabla de materiales). Cargue 150 μL de medio en el pocillo superior derecho. Después de 90 s o cuando el líquido pase a través del canal derecho hacia el pocillo inferior derecho, agregue 150 μL al pocillo inferior derecho. Espere 5 minutos para que el medio fluya a través de las microranuras.
- Agregue 150 μL de medio en el pocillo superior izquierdo y otros 150 μL en el pocillo inferior izquierdo. Incubar el chip en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 para preacondicionar el chip hasta que esté listo para sembrar NSCs.
nota: Las papas fritas se pueden preacondicionar durante la noche si es necesario.
>2. Inicialización de NSC en el chip multicompartimento
NOTA: Este protocolo utiliza NSCs compradas comercialmente, a diferencia de nuestra publicación anterior que comenzó con células madre embrionarias humanas. En este protocolo, las células madre neurales se colocan directamente en los chips de plástico, donde se diferencian en neuronas. Se puede permitir que las células proliferen como NSC (sin diferenciación) durante un máximo de 2 conductos y almacenarse en viales en N2 líquido para su uso posterior. Este protocolo utiliza viales de NSC almacenados en el líquido N2 después del paso 1 o 2. La Figura 2B muestra una descripción general de los procedimientos de recubrimiento.
- Descongele los NSC de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
nota: Este procedimiento se aplica a las NSC derivadas de H9. Otras líneas celulares requerirán optimización de la densidad celular.
- Cuente la concentración de células con un hemocitómetro y ajústela con medios NSC para obtener una concentración de 7 x 106 células por ml.
- Aspire los medios de cada pocillo del chip. Evite aspirar medios de los canales principales.
- Pipetear 5 μL de la solución celular en el pocillo superior derecho, seguido de 5 μL en el pocillo inferior derecho (70.000 células en total). Asegúrese de que las celdas estén pipeteadas hacia las aberturas del canal principal. Use un microscopio para verificar que las células hayan ingresado al canal. Espere 5 minutos para que las células se adhieran a la parte inferior del chip.
nota: Se puede utilizar uno o ambos compartimentos para cargar células.
- Pipetee ~ 150 μL de medio NSC en el pocillo superior derecho y luego 150 μL en el pocillo inferior derecho. Repita en el lado izquierdo. Incubar al 5% de CO2, 37 °C dentro de un recipiente humidificado adecuado.
- Después de 48 horas, aspire el medio NSC de los pocillos y reemplácelo con un medio de diferenciación neuronal agregando 150 μL a cada pocillo superior y a cada pocillo inferior.
- Cultive las neuronas dentro de una incubadora de 5% CO2, a 37 °C dentro de un recipiente humidificado adecuado.
