$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparación de soluciones
- Prepare una solución de disociación tisular hecha de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) estéril que contiene rojo de fenol con papaína (100 U/ml), cisteína (0,2 mg/ml) y desoxirribonucleasa (DNasa, 250 U/ml).
- Para preparar la solución de DNasa, diluya 100 mg del polvo liofilizado de DNasa I (un frasco) en 50 mL deH2O. Mezcle bien y filtre la solución madre. Prepare 10 mL de alícuotas de caldo. Divida un tubo original en alícuotas de un solo uso de 0,5 ml. Almacene estas alícuotas de un solo uso a -80 °C.
- Preparación de reactivos de separación magnética mediante la preparación de tampón de columna magnética X: 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
- Para preparar el medio neurosphere, utilice un medio neurobasal que contenga penicilina/estreptomicina con L-glutamina y suplemente con B27 al 2%, 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF) recombinante humano y 20 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF).
- Para preparar el medio de diferenciación, utilice un medio neurobasal y complemente con 10 ng/mL de factor diferenciado de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA) o 10 ng/mL de factor inhibidor de la leucemia (LIF) y B27 al 2%.
- Utilice placas de cultivo de 12 pocillos (3,5 cm2) y 6 pocillos (9,6 cm2) de fijación ultrabaja.
>2. Disección del cerebelo
- Anestesiar a las crías de ratón (P3-P7) con isoflurano y decapitarlas con tijeras quirúrgicas.
- Rocíe las cabezas separadas de los cachorros con etanol al 70%.
- Transfiera cada cabeza a una placa de cultivo estéril vacía de 10 cm. Separe la piel con unas tijeras de microdisección, luego retire el cráneo pasando las tijeras sagitales a lo largo de la línea media.
- Con las pinzas #7, despegue los huesos del cráneo comenzando caudalmente desde el tronco encefálico. Levante cuidadosamente el cerebro con una espátula, manteniendo el cerebelo intacto, y transfiera el cerebro a un plato estéril fresco de 10,0 cm que contenga 15 ml de solución helada de sal equilibrada de Hanks (HBSS).
- Coloque el plato que contiene el cerebro bajo un microscopio de disección. Con pinzas finas #5, retire las meninges y los vasos sanguíneos grandes del cerebelo y separe el cerebelo del tronco encefálico con la espátula.
- Transfiera el cerebelo a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 5.0 mL de solución de HBSS helada. Lave el cerebelo enjuagando y decantando 3 veces con 5.0 mL de HBSS.
nota: Cada cerebelo debe colocarse en su propio tubo para su posterior procesamiento.
>3. Preparación de la suspensión celular
- Coloque el plato que contiene el cerebro bajo un microscopio de disección. Con pinzas finas #5, retire las meninges y los vasos sanguíneos grandes del cerebelo y separe el cerebelo del tronco encefálico con la espátula.
- Transfiera el cerebelo a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 5.0 mL de solución de HBSS helada. Lave el cerebelo enjuagando y decantando 3 veces con 5.0 mL de HBSS.
nota: Cada cerebelo debe colocarse en su propio tubo para su posterior procesamiento.
- Después del último enjuague, añadir 5 mL de solución de disociación de tejidos a base de papaína que haya sido precalentada a 37 °C. Incubar el tejido durante 15 min a 37 °C en un baño de agua. Mezcle lentamente el contenido invirtiendo el tubo hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces cada 3 minutos, ya sea con una batidora de nutas o con la mano.
- Prepare una pipeta Pasteur de diámetro ancho (regular de vidrio) y de diámetro estrecho (pulida al fuego calentándola sobre un mechero Bunsen) como se ha descrito anteriormente.
- Lavar el tejido 3 veces con 5 mL de solución de HBSS, evitando la pérdida del tejido durante la decantación a mano.
- Retire el último lavado de HBSS y agregue 5 mL de solución de DPBS que contenga 250 μL de solución de DNasa al tejido. Disocie el tejido triturando de 10 a 15 veces con la pipeta Pasteur de gran diámetro. Realice este paso con cuidado para evitar la formación de burbujas.
- A continuación, incubar la suspensión durante 10 minutos más a 37 °C en el baño de agua, mezclando invirtiendo y enderezando el tubo.
- Utilice la pipeta Pasteur de diámetro reducido para triturar aún más la suspensión de tejido 10 veces. Si quedan trozos grandes de tejido, presione los trozos de tejido contra el fondo del tubo con la punta de la pipeta suavemente y continúe pipeteando hasta que las células alcancen una suspensión fina.
- Incubar el tejido a 37 °C durante 10 minutos más, repitiendo los pasos de mezcla anteriores.
>4. Inmunomarcaje de células madre
- Coloque los tubos de centrífuga en hielo y use soluciones heladas para los siguientes pasos. Cuele las células disociadas a través de un filtro de células de 40 μm en un tubo de centrífuga de 50 mL. Cubra el filtro con 10,0 ml de solución de HBSS para garantizar que las células pasen a través de la malla en esta solución adicional.
- Transfiera las células filtradas a un tubo de centrífuga nuevo de 15 ml y centrifuga la suspensión de células a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspire y deseche completamente el sobrenadante utilizando cuidadosamente un aspirador de vacío.
- Vuelva a suspender el pellet en 160 μL de tampón de columna magnética. Para obtener la suspensión de una sola célula antes del etiquetado magnético, pase las células a través de una malla de nailon de 30 μm para eliminar los grupos de células, que de otro modo podrían obstruir la columna.
- Agregue 40 μL de microperlas anti-promina-1 a cada tubo de 15 mL, mezcle e incube en un refrigerador durante 15 minutos para que el anticuerpo se una a las células que expresan promina-1.
- Lave las células añadiendo 1,0-2,0 mL de tampón de columna X y centrifugue a 300 x g durante 10 min. Aspire el sobrenadante por completo.
- Vuelva a suspender el pellet en 1,0 mL del tampón de columna X.
nota: Si se observan pequeños grumos después de la resuspensión del pellet con 1,0 mL de tampón de columna X, deben eliminarse con cuidado con la punta de la pipeta Pasteur, de lo contrario, estos grumos pueden bloquear la columna magnética durante la clasificación de células.
>5. Preparación de columnas magnéticas, clasificación de células y enchapado
>NOTA: La separación magnética de diferentes condiciones de genotipo (enfermedad vs. control) debe realizarse al mismo tiempo, ya que cualquier retraso puede afectar la morfología de la neurosfera.
- Prepare las columnas magnéticas colocándolas en el soporte magnético expuesto al campo magnético. Enjuague la columna una vez con 500 μL de tampón X aplicando tampón que gotea en un tubo de centrífuga para desechar.
nota: Prepare un tampón de columna magnética X nuevo para cada experimento; De lo contrario, la producción de células madre será baja.
- Aplique la suspensión de celda etiquetada en la columna. Recoja el flujo que contiene células no marcadas que consisten principalmente en células mixtas neuronales/gliales cerebelosas en tubos frescos de 15 ml (Figura 1A).
- Lave la columna 3 veces con 500 μL de tampón X (cada lavado dura alrededor de 2-4 min).
nota: El cultivo mixto de neuronas cerebelosas/gliales enriquecido con neuronas granulares cerebelosas puede servir como un subproducto útil de este paso de purificación.
- Retire la columna del campo magnético y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Agregue 1,0 mL de medio de cultivo (medio de neurosfera) a la columna y empuje el émbolo dentro de la columna para eliminar las células marcadas con perlas de prominina-1 en un tubo de halcón nuevo de 1,5 mL.
- Para mejorar la pureza de las células marcadas con prominina-1, pase las células eluidas por una segunda columna siguiendo los pasos 5.1-5.4.
- Cuente las células con un hemocitómetro. El rendimiento típico es de 10a 7 células por cerebelo. Coloque las celdas en placas de fijación ultra bajas (6 o 12 pocillos, según la densidad requerida para los experimentos posteriores).
>6. Aprobación de las neuroesferas y la diferenciación
- Coloque las células madre marcadas con prominina-1 en placas de 12 pocillos de fijación ultra baja en medio neurosphere (5.000 células/pocillo).
- Después de 7 a 10 días, las células se dividen para producir neuroesferas flotantes en forma de bola (neuroesferas primarias).
nota: En este experimento, se generan neuroesferas secundarias que se expanden en número para su uso posterior. Las poblaciones primarias de la neurosfera no se utilizan para estos experimentos, ya que pueden contener células contaminantes que no tienen propiedades de células madre y pueden agruparse con las neuroesferas.
- Para el paso, transfiera las neuroesferas primarias junto con los medios de cultivo utilizando puntas de pipeta de 1,0 mL a un tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Granular las neuroesferas por centrifugación a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de medio de disociación de tejidos que contenga papaína o solución de tripsina al 0,05%. Incubar a 37 °C durante 10 min.
- Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min. Vuelva a suspender las células en 5 mL de medio neurosphere y disocie las células mecánicamente con una pipeta Pasteur de plástico y pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
- Coloque las células (de nuevo) en el medio de la neurosfera como se describió anteriormente. Después de 7-10 días de cultivo, la placa debe enriquecerse con neurosferas secundarias.
nota: Estos cultivos pueden pasar hasta 8 veces con buena eficiencia, después de lo cual el tamaño de la neurosfera tiende a ser más pequeño y sugiere una disminución de la proliferación.
- Cuente las células en el hemocitómetro y coloque el número óptimo para futuros experimentos en placas recubiertas de poli-D-lisina (6 o 12 pocillos).
- Para diferenciar las células madre, recoja las neuroesferas del segundo al octavo paso por centrifugación como se describió anteriormente, excepto que agregue un medio de diferenciación al pellet.
nota: Después de 7 días in vitro, las células madre se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, como se demuestra mediante tinción con el marcador neuronal β-III tubulina, el marcador astrocítico Glial fibrilar acid protein (GFAP) y el marcador de oligodendrocitos O4.
