Coculturación de neuronas ganglionares de la retina con glía de envoltura olfativa

Resumen

Fuente: Portela-Lomba, M., et al. Cocultivo de Neuronas Gangliales de la Retina de Rata Axotomizadas con Glia de Envoltura Olfativa, como Modelo In Vitro de Regeneración Axonal Adulta. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra el procedimiento para aislar neuronas ganglionares de la retina (RGNs) de la retina de una rata y cocultivarlas con células de glía de envoltura olfativa (OEG). Este método permite estudiar el potencial neuro-regenerativo de los OEG después de una lesión neuronal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de ihOEG (Ts12 y Ts14) para el ensayo

NOTA: Este paso debe realizarse 24 h antes de la disección y el cocultivo de RGN.

1. Trate los cubreobjetos de 12 mm de Ø con 10 μg/mL de poli-L-lisina (PLL) durante 1 h.
   nota: Los cubreobjetos se pueden dejar toda la noche en la solución PLL.
2. Lave los cubreobjetos con 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) tres veces.
3. Separe las células ihOEG Ts12 y Ts14 de la placa de cultivo celular p60.
   1. Añadir 4 mL de medio de cultivo DMEM/F12 (medio basal)-FBS (suero fetal bovino) a un tubo cónico de 15 mL. Calentar a 37 °C en un baño de agua limpia.
   2. Retire el medio de las placas y lave las células con 1 mL de 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato)-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) una vez.
   3. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA a las células OEG e incubar durante 3-5 min a 37 °C, 5% de CO₂.
   4. Recoja las células con una pipeta p1000 y transfiéralas al medio preparado en el paso 2.1.
   5. Centrífuga durante 5 min a 200 x g.
   6. Aspira al sobrenadante.
   7. Agregue 1 mL de medio ME10 y vuelva a suspender el pellet.
   8. Cuente el número de células en un hemocitómetro.
4. Siembre 80.000 células Ts14 o 100.000 células Ts12/pocillo en los cubreobjetos en placas de 24 pocillos en 500 μL de medio ME10.
5. Cultivar células a 37 °C en 5% CO₂ durante 24 h.

>2. Disección del tejido de la retina

NOTA: Las ratas Wistar macho de 2 meses de edad se utilizan como fuente de RGN. Dos retinas (una rata) para 20 pocillos de una placa de celdas de 24 pocillos. Autoclave de material quirúrgico antes de su uso. El kit de disociación de papaína se compra comercialmente (Tabla de Materiales). Siga las instrucciones del proveedor para la reconstitución. Reconstituya el ácido D, L-2-amino-5-fosfonovalérico (APV) en un caldo de 5 mM y prepare las alícuotas.

1. El día del ensayo, prepare los siguientes medios.
   1. Prepare una placa de cultivo celular p60 con 5 mL de EBSS fría (solución salina equilibrada de Earle) (vial 1 del kit de disociación de papaína).
   2. Prepare una placa de cultivo celular p60 con el vial reconstituido 2 (papaína) del kit de disociación de papaína más 50 μL de APV. A continuación, añadir 250 μL de vial reconstituido 3 (DNasa más 5 μL de APV).
   3. En un tubo estéril, mezclar 2,7 mL del vial 1 con 300 μL del vial 4 (inhibidor de la proteasa albúmina-ovomucoide). Añadir 150 μL de vial 3 (DNasa) más 30 μL de APV.
   4. Prepare 20 mL de medio Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Sacrifica una rata por asfixia con CO₂.
3. Retire la cabeza por decapitación con una guillotina; colóquela en una placa de Petri de 100 mm y rocíe la cabeza con etanol al 70% antes de colocarla en una campana de flujo laminar.
4. Corta los bigotes de la rata con unas tijeras para que no interfieran con la manipulación del ojo.
5. Agarre el nervio óptico con pinzas para extraer el globo ocular lo suficiente como para poder hacer una incisión en el ojo con un bisturí.
6. Retire el cristalino y el humor vítreo y extraiga la retina (tejido similar a la naranja) mientras que las capas restantes del ojo (incluida la capa epitelial pigmentaria) permanecen adentro.
7. Coloque la retina en la placa de cultivo celular p60 preparada en el paso 2.1.1.
8. Transfiera la retina a la placa de cultivo celular p60 preparada en el paso 2.1.2 y córtela con el bisturí en trozos pequeños de tamaño aproximado < 1 mm.
9. Transfiera a un tubo de plástico de 15 mL.
10. Incubar el tejido durante 30 min, en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% de CO₂, con agitación cada 10 min.
11. Disocie los grupos de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur de vidrio.
12. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min.
13. Deseche el sobrenadante. Para inactivar la papaína, vuelva a suspender el pellet celular en la solución preparada en el paso 2.1.3 (1,5 mL para 2 ojos).
14. Pipetear cuidadosamente esta suspensión celular en 5 mL de vial reconstituido 4.
15. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
16. Durante la centrifugación, retire completamente el medio ME-10 de la placa de celda OEG de 24 pocillos (previamente preparada en el paso 1) y reemplácela con 500 μL de medio NB-B27 por pocillo.
17. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mL de medio NB-B27.
18. Placa de 100 μL de suspensión de células de retina, por pocillo de la placa m24, sobre cubreobjetos monocapas tratados con PLL o OEG.
19. Mantener los cultivos a 37 °C con 5% de CO₂ durante 96 h en medio NB-B27.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suplemento B-27	Gibco	17504044
Ácido D,L-2-amino-5-fosfonovalérico	sigma	283967	Inhibidor del receptor NMDA
DMEM-F12	Gibco	11320033	Medio de cultivo celular
FBS	Gibco	11573397	Suero fetal bovino
FBS-Hyclone	Fisher Científico	16291082	Suero fetal bovino
L-Glutamina	Lonza	BE17-605F
Medio Neurobasal	Gibco	21103049	Medio de cultivo de células neuronales
Sistema de disociación de papaína	Corporación Bioquímica de Worthington	LK003150	Para su uso en el aislamiento de células neuronales
Pbs	Hecho en casa
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Penicilina/Estreptomicina/Anfotericina B	Lonza	17-745E	Bacteriostático y bactericida
Extracto de hipófisis	Gibco	13028014	Extracto de hipófisis bovina
Poli-L-lisina (PLL)	sigma	A-003-M