Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Manchas de gel de matriz extracelular
- Realice los siguientes pasos un día antes del aislamiento:
- Descongelar una alícuota de gel de matriz extracelular (100 μl) a 4 °C durante al menos 1,5 horas. Diluir 1:10 en el medio Eagle modificado de Dulbecco, con 4.500 mg/L de glucosa, 4 mM de L-glutamina y 110 mg/ml de piruvato de sodio (DMEM). Mantenga el gel de matriz extracelular a 4 °C en todo momento.
NOTA: Los cambios bruscos de temperatura darán como resultado un recubrimiento desigual y la formación de cristales.
- Mantenga la solución de gel de matriz extracelular diluida en hielo durante 15 min.
- Enfriar previamente una micropipeta de 20 μl durante 10 min.
- Coloque los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos en una placa de Petri de 100 mm y transfiera la placa a una superficie fría (por ejemplo, un paquete de congelador) durante 10 minutos.
- Utilice la micropipeta preenfriada para poner una gota de 10 μl de gel de matriz extracelular en cada pocillo. Mantenga la placa de Petri sobre la superficie fría durante al menos otros 7 minutos (Figura 1A).
- Retire completamente el gel de matriz extracelular restante (Figura 1B) y seque los pocillos a 37 °C durante la noche.
>2. Disección de los músculos de la cabeza (masetero, digástrico y elevador veli palatini)
- Antes de la disección, prepare 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con penicilina-estreptomicina (P/S) al 2%. Mantener en hielo.
- Después de la eutanasia de una rata adulta joven (9 semanas) con CO2/O2, decapitar la cabeza y quitar la piel de la cabeza. Transfiera la cabeza a PBS helado suplementado con 2% P/S en un tubo de 50 ml.
- Músculo masetero (derivado del 1er arco branquial)
- Coloque la cabeza con un lado hacia arriba sobre una almohadilla de silicona y fíjela con agujas hipodérmicas (Figura 2A).
- Identifique la glándula parótida y el nervio facial (Figura 2A). Exponga la fascia profunda que cubre la glándula. Corta la fascia y retira la glándula con unas tijeras de disección. Identificar el conducto auditivo externo. Traza el nervio facial desde el agujero estilomastoide y retira con cuidado las ramas temporal, cigomática y bucal con una hoja de bisturí n.º 15.
- Libera la cabeza superficial del músculo masetero eliminando la fascia. Identificar las cabezas superficiales y profundas del músculo masetero. Trazar la cabeza superficial hasta que su aponeurosis tendinosa gruesa se inserte en la apófisis cigomática del maxilar.
- Separe el tendón de su origen en la apófisis cigomática con pinzas rectas. Córtelo con una hoja de bisturí n.º 15 o unas tijeras de disección y levántelo con cuidado (Figura 2B).
- Diseccionar la cabeza superficial del masetero hasta su inserción en el ángulo y la mitad inferior de la superficie lateral de la rama de la mandíbula con una hoja de bisturí n.º 15 (Figura 2C). Ahora, retira completamente el músculo.
- Vientre posterior del músculo digástrico (derivado del 2º arco branquial)
- Coloque la cabeza en posición supina sobre la almohadilla de silicona y fíjela con agujas hipodérmicas (Figura 3A).
- Eliminar la grasa subcutánea que recubre las glándulas sublinguales y submandibulares. A continuación, retire la fascia superficial y las glándulas con unas tijeras de disección. Exponer el músculo digástrico (vientre anterior y posterior).
- Sujetar el tendón anterior del vientre posterior con pinzas rectas, cortarlo y diseccionarlo cuidadosamente hasta que su origen esté en la bulla timpánica (Figura 3B). Haz lo mismo en el lado contralateral.
- Músculo elevador del músculo palatino (derivado del 4º arco branquial)
- Después de la disección del vientre posterior del músculo digástrico, localice el músculo estilohioideo, tire de él lateralmente y retírelo con cuidado (Figura 4A).
- Localizar el tendón del elevador del velo palatino que se inserta en la bulla timpánica (Figura 4A). Diseccionarlo con cuidado y cortarlo por ambos lados.
- Busca la tráquea y el esófago que corre detrás de ella. Levante el esófago y exponga la faringe y la laringe.
- Localizar y diseccionar el área del músculo constrictor faríngeo superior. Identifique el elevador del velo palatino y córtelo por ambos lados (Figura 4B)
nota: Inmediatamente después de la disección, extraiga cuidadosamente el tendón y el tejido conectivo de cada músculo bajo el microscopio estereoscópico. Sumerja rápidamente todas las muestras en etanol al 70% y transfiéralas a PBS helado suplementado con P/S al 2% en un tubo de 15 ml.
>3. Aislamiento de células satélite (SC)
- Realice los siguientes pasos de preparación para el aislamiento del SC de los tres grupos musculares:
- Preparar 7,5 ml de pronasa al 0,1% en DMEM. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Precalentar la solución a 37 °C en un baño de agua durante 10 minutos antes del aislamiento.
- Prepare 35 ml de DMEM suplementado con un 10% de Suero de Caballo (HS) y un 1% de P/S. Además, precalentar a 37 °C en un baño de agua.
- Prepare 15 ml de medio de cultivo que consiste en DMEM suplementado con 20% de suero fetal bovino (FBS), 10% HS, 1% P/S y 1% de extracto de embrión de pollo (CEE). Precalentar a 37 °C en un baño de agua.
- Revise previamente seis pipetas de plástico (10 ml) con HS y séquelas durante al menos 10 minutos antes de usarlas.
- En la campana de cultivo, transfiera cada músculo a un pocillo de una placa de 6 pocillos. Con las tijeras de disección, corte el músculo en trozos pequeños de unos 2 mm. Tenga cuidado de no picar demasiado el tejido.
- Añadir con cuidado 2,5 ml de solución de pronasa al 0,1% a cada pocillo e incubar a 37 °C durante 60 min. Agitar suavemente el plato después de 20, 40 y 60 min.
nota: La duración exacta de la incubación depende de factores como la edad y la cepa de los animales.
- Monitoree bajo el microscopio. Revise los fragmentos musculares y detenga la digestión enzimática cuando los haces de fibras parezcan aflojarse (Figura 5).
- Añadir 2,5 ml de DMEM suplementado con 10% HS y 1% P/S. Transferir a un tubo de 15 ml y centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante por decantación.
- Añadir 5 ml de DMEM suplementado con un 10% de HS y un 1% de P/S. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de plástico de 10 ml (trituración) al menos 20 veces para homogeneizar el tejido.
- Centrifugar los tubos a 200 x g durante 4 min. Recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo de 15 ml.
- Añadir 5 ml de DMEM suplementado con un 10% de HS y un 1% de P/S. Pipetear de nuevo con una pipeta de plástico de 10 ml hasta que los fragmentos de tejido pasen fácilmente.
- Centrifugar los tubos a 200 x g durante 4 min y recoger el sobrenadante en un tubo de 15 ml.
- Coloque un colador de células (40 μm) en un tubo de 50 ml y transfiera el sobrenadante que contiene las células disociadas al filtro. Lavar con 1 ml de DMEM para una máxima recuperación celular.
- Centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante con una pipeta.
- Vuelva a suspender el pellet en un medio de cultivo de 300 μl y cuente las células en un hemocitómetro.
>4. Diferenciación de células satélite en manchas de gel de matriz extracelular
- Diluir la suspensión celular para obtener 1,5 x 103 células en 10 μl de medio de cultivo.
- Asegure las cubiertas de los portaobjetos de la cámara con cinta adhesiva y marque los puntos con un marcador negro en la parte inferior del vidrio del objeto.
- Con una micropipeta, coloque una gota de suspensión celular de 10 μl en la mancha de gel de la matriz extracelular. Compruebe bajo el microscopio si la gota de suspensión celular se ha colocado correctamente en el lugar. Incubar durante seis horas a 37 °C.
- Añadir con cuidado 400 μl de medio de cultivo (DMEM suplementado con 20% de FBS, 10% HS, 1% P/S y 1% CEE) e incubar durante tres días a 37 °C.
nota: En este punto, los SC recién aislados son sometidos a un trauma masivo (digestión enzimática y trituración dura) y necesitan recuperarse. No moleste las celdas durante los primeros tres días. A continuación, se puede cambiar el medio de cultivo según el tipo de experimento.
Las manchas de gel de la matriz extracelular se pueden sembrar con una alta densidad celular (1,5-2,5 x 103/20 μl) para el ensayo de diferenciación. El medio de cultivo (DMEM suplementado con 20% de FBS, 10% de HS, 1% de P/S y 1% de extracto de embrión de pollo) se puede reemplazar cada tercer día.
