Neurogénesis inducida por ácido retinoico utilizando células de carcinoma embrionario de ratón

Resumen

Fuente: Leszczyński, P., et al., Neurogénesis utilizando células de carcinoma embrionario P19 J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra una técnica simple para la neurogénesis inducida por ácido retinoico en células de carcinoma embrionario de ratón P19. El ácido retinoico activa los factores de transcripción y desencadena la expresión génica para la diferenciación neuronal.

Protocolo

1. Generación de agregados

1. Añadir 5 μL de RA (ácido retinoico) (1 mM de caldo disuelto en etanol al 99,8%, almacenado a -20 °C) a los 10 mL de Medio de Diferenciación y mezclar bien (concentración final de 0,5 μM de RA).
   nota: La artritis reumatoide es sensible a la luz. Una baja concentración de etanol no afecta a la diferenciación celular.
2. Añada 10 mL de medio de diferenciación (con AR) a la placa de cultivo no tratada de 100 mm (dedicada al cultivo en suspensión).
3. Siembre las 1 x 10⁶ celdas en el plato de 100 mm (superficie del plato 56,5 cm2).
4. Coloque el matraz con células en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante 2 días para promover la formación de agregados.
5. Después de 2 días, cambie el medio de diferenciación. Aspire el medio que contiene agregados con una pipeta de 10 mL y transfiéralo a un tubo de 15 mL en RT.
6. Deje que los agregados se asienten por gravedad durante 1,5 min en RT.
7. Deseche el sobrenadante.
8. Añada 10 mL de medio de diferenciación con 0,5 μM de RA utilizando una pipeta serológica de 10 mL.
   cautela: No pipetee los agregados celulares hacia arriba y hacia abajo.
9. Siembre los agregados en una nueva placa de cultivo sin tratar de 100 mm (dedicada al cultivo en suspensión).
10. Coloque la placa en la incubadora (a 37 °C y 5% de CO₂) durante 2 días.

>2. Disociación de agregados

1. Aspire los agregados celulares con una pipeta de 10 mL.
2. Transfiera los agregados a un tubo de 15 mL. Deje que los agregados de células se asienten por gravedad durante 1,5 minutos.
3. Retire el sobrenadante.
4. Lave los agregados con DMEM solo (sin suero ni antibióticos).
5. Deje que los agregados celulares se asienten por sedimentación por gravedad durante 1,5 min en RT.
6. Aspirar el sobrenadante y añadir 2 mL de tripsina-EDTA (0,25%).
7. Coloque los agregados celulares en un baño de agua (37 °C) durante 10 min. Agite los agregados suavemente cada 2 min golpeando con la mano.
8. Detenga el proceso de tripsinización agregando 4 mL de medio de mantenimiento.
9. Pipetear los agregados hacia arriba y hacia abajo 20 veces con una pipeta de 1 mL.
10. Celdas centrífugas durante 5 min a 200 x g y RT.
11. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 mL de medio de mantenimiento.
12. Determine el número de celda con un contador de celdas.

>3. Celdas de enchapado

1. Agregue 3 mL por pocillo de medio de mantenimiento a una placa de 6 pocillos.
2. Células de siembra en la placa de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 0,5 x 10⁶/pocillo.
3. Incubar a 37 °C con una concentración de CO₂ del 5%.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM glucosa alta (4,5 g/L) con L-glutamina	Lonza	BE12-604Q
Etanol 99,8%	Chempur	QUÍMICA*613964202
Suero fetal bovino (FBS)	EURx	E5050-03
Penicilina/Estreptomicina 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x concentrada sin iones de calcio y magnesio	Lonza	BE17- 517Q
Ácido retinoico	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	Disuelto en etanol al 99,8%; almacenamiento en -20 °C hasta 6 meses
Tripsina 0,25% - EDTA en HBSS, sin iones de calcio y magnesio, con rojo de fenol	Biosera	LM-T1720/500
Pipetas serológicas de 1 mL	Profilab	515.01
Pipetas serológicas de 10 mL	Profilab	Artículo 515.1
Plato de 100 mm dedicado al cultivo en suspensión	Corning	C351029
Tubos de centrífuga de 15 mL	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
Pipetas serológicas de 5 mL	Profilab	515.05
Placa de 6 pocillos	Corning	CLS3516
Matraces de cultivo celular, superficie cuadrada de 25 cm	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA