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>1. Cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
- Prepare el medio MEF, el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM, alto en glucosa), complementado con un 15% de suero fetal bovino (FBS).
- Cubra las placas de cultivo celular de 100 mm con una solución de gelatina al 0,5% durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Cuente los MEF con un citómetro. Retire la solución de gelatina y vierta inmediatamente el medio MEF precalentado a 37 °C. Descongele rápidamente los viales de MEF tratados con mitomicina C en un baño de agua a 37 °C durante 2 min, luego siembre 2,8 x 106 MEF por plato recubierto de gelatina de 100 mm. Ajuste el número de celda en consecuencia si usa platos de otros tamaños. Incubar MEFs durante la noche a 37 °C, 5% de CO2.
- Cambia el medio al día siguiente. Cultivo durante 2-3 días hasta que la capa de MEF sea confluente.
>2. Cultivo de células madre embrionarias de ratón o ESC
- Prepare el medio ESC, el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) suplementado con 15% de FBS y 103 U/mL de factor inhibidor de la leucemia (LIF), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 55 mM de 2-mercaptoetanol, penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL), gentamicina (200 μg/mL) y 0,2% de antibiótico micoplasma.
- Retire el medio MEF del plato preparado en el paso 1 y reemplácelo con medio ESC precalentado a 37 °C.
- Descongele un vial de ESC y las células de siembra en la parte superior de la capa de MEF. Incubar a 37 °C, 5% de CO2, hasta que las ESC alcancen la confluencia.
- Preparar nuevas placas de cultivo celular que contengan una monocapa confluente de MEFs. Para el paso de las ESC, lavar una vez con PBS y separar con tripsina/EDTA al 0,25% durante 2-5 min a 37 °C, 5% de CO2. Detenga la tripsinización añadiendo IMDM fresco con un 15% de FBS a las células que se desprenden, transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugue a 160 x g durante 5 min en RT.
- Retire el sobrenadante, vuelva a suspender las ESC con IMDM fresco y pase una quinta parte de las células a cada nueva placa recubierta de MEF; incubar hasta que las células alcancen la confluencia (generalmente 4-5 días).
>3. Retirar MEFs y Cultivos ESCs en placas recubiertas de gelatina
- Una vez que los ECS alcancen la confluencia, sepárelos y separa los MEF con tripsina/EDTA al 0,25% como en el paso 2.4, vuelva a suspender las células en IMDM fresco, transfiéralas a una placa de Petri bacteriológica no adhesiva e incube durante 40 min a 37 °C, 5% de CO2.
- Transfiera con cuidado el medio que contiene ESC y MEF a una nueva placa recubierta de gelatina con una pipeta de 5 ml, evitando el pipeteo repetido. Las células que quedan en las placas de Petri son MEFs ya que las ESC no se adhieren.
- Pase los ESC cada 3-4 días. Un paso menos frecuente puede reducir la pluripotencia de las ESC. No superar el 60% de confluencia, ya que puede favorecer la diferenciación.
- Repita los pasos 3.2-3.3 tres veces o más, según sea necesario, hasta que los MEF ya no sean detectables por un microscopio de cultivo celular, utilizando un objetivo 20X, para asegurarse de que los MEF no estén presentes.
- Verifique la pluripotencia de ESC mediante el cultivo de ESC para ver si las células forman colonias densas con morfología poligonal típica de ESC (Figura 1A). Pruebe la madre celular mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR), inmunotransferencia o inmunofluorescencia de los factores de transcripción de pluripotencia central (Figura 2).
4. Formación EB
- Prepare una solución madre totalmente trans-RA a 10 mM en DMSO y alícuota en tubos de microfuga protegidos con luz de 1,5 mL. La solución es estable a -80 °C durante un máximo de dos semanas. Protégelo de la luz.
- Tripsinizar las ESC como en el paso 2.4; replatear en IMDM fresco sin LIF como una suspensión de una sola celda.
- Cuente las células con un hemocitómetro y prepare una suspensión de 5 x 105 células/mL en IMDM con 0,5 μM de AR.
- Placa 100 gotas de 20 μL por placa de Petri de 100 mm con una pipeta de 8 canales y puntas de 200 μL, invierta los platos y llene la tapa invertida con PBS para evitar que las gotas colgantes se sequen. Proteja de la luz los medios de cultivo que contienen AR.
- Cultivo de EBs en gotas colgantes a 37 °C, 5% CO2, durante 4 días.
