1. Clonación de 2K7 Lentivector
- Antes de clonar el gen de interés en el vector lentiviral 2K7, subclona el gen en el vector pENTR (3637 pb, resistente a la kanamicina) utilizando técnicas moleculares estándar. Utilice los sitios de restricción EcoRI y SacII para la subclonación.
- Amplificación del Lentivector 2K7
- Transforme el ADN lentivectorial 2K7 mezclando suavemente 100 ng de ADN plásmido con células competentes e incube en hielo durante 30 minutos.
- Las células de ADN / competentes de choque térmico se mezclan a 42 °C durante 90 segundos y las colocan en placas de agar LB que contienen ampicilina (100 μg/ml) y cloranfenicol (15 μg/ml) a 37 °C durante 16-18 hr.
NOTA: El cloranfenicol se utiliza para evitar la recombinación entre las repeticiones terminales largas.
- Al día siguiente, cultive clones de bacterias seleccionadas en medios Luria-Bertani (LB) que contengan ampicilina (100 μg/ml) y cloranfenicol (15 μg/ml) a 37 °C durante 16-18 horas. Extraiga el ADN utilizando un kit comercial de Maxiprep de ADN plasmídico según las instrucciones del fabricante.
- Subclonación de vector pENTR a Lentivector 2K7 (Figura 1).
- Añadir a un tubo de 1,5 ml y mezclar suavemente: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotor) (60 bng)1-2,5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (con gen de interés) (80 bng)1-2,5 μl Lentivector K7 (80 ng/μl)1 μl TE-tampón, pH 82-5 μl.Total 8 μl.
- Retire la mezcla de enzimas clonasas a -80 °C y descongele en hielo durante 2 min. Asegúrese de que esta enzima sea una alícuota fresca de -80 °C, ya que la enzima ha reducido sustancialmente la eficiencia de la clonación con ciclos repetidos de congelación y descongelación
- Añadir 2 μl de enzima por reacción y mezclar bien mediante vórtice, e incubar la mezcla de reacción de clonasa a 23-25 °C durante 6-24 horas.
- Añadir 1 μl de solución de proteinasa K (suministrada con el kit de enzimas) a la mezcla de reacción de clonasa e incubar durante 10 min a 37 °C.
- Transformar la mezcla de reacción de clonasa en células competentes y cultivar las colonias seleccionadas en medios LB que contengan ampicilina (100 μg/ml) a 37 °C durante 16-18 h.
- Extraiga y purifique el ADN utilizando un kit comercial de minipreparación de ADN plásmido según las instrucciones del fabricante.
- Confirme el ADN a través de la digestión utilizando las enzimas de restricción Spe I y Sac II y un tampón apropiado según las instrucciones del fabricante para eliminar el fragmento que contiene el promotor y el gen de interés><.
NOTA: Este paso es fundamental para comprobar si el ADN subclonado tiene el gen de inserción correcto de interés con la columna vertebral del vector correcta. El tamaño del vector en sí sin el fragmento insertado es de 6,7 kb. El tamaño del fragmento insertado liberado incluye tanto el promotor como el gen insertado de interés. Calcule los tamaños de fragmento esperados del resumen para el gen específico a través de un programa de edición de secuencias de ADN, por ejemplo, APE-A Plasmid Editor.
- Compruebe los tamaños tanto de la columna vertebral del vector de ADN como del fragmento liberado ejecutando un gel de agarosa al 1% en un tampón TAE 1x (ver Tabla 1) a 100 V.
- Amplifique el ADN confirmado mediante el crecimiento de bacterias en 500 ml de medios LB que contengan ampicilina (100 μg/ml) a 37 °C durante 16-18 horas.
- Extraiga y purifique el ADN utilizando un kit comercial de ADN plasmídico Maxiprep según las instrucciones del fabricante.
nota: Maxiprep suele generar una cantidad suficiente de ADN necesaria para la producción viral.
- Repita los pasos 1.3.9-1.3.10 para amplificar los siguientes ADNs para preparaciones lentivirales: Vector de envoltura (PMD2. G, 6,1 kb), vector de paquete (pBR8,91, 12,5 kb) y un vector lentiviral vacío como control (GFP-CMV-2K7, 8,7 kb).
>2. Producción de virus 2K7
NOTA: Día 1:
- El día de la transfección, coloque 32 millones de linfocitos T HEK293 en un matraz T175 que contiene 25 ml de medios de linfocitos T 293 de riñón embrionario humano (HEK) (véase la Tabla 1). Alternativamente, coloque 16 millones de células el día antes de la transfección si el tiempo apremia el día de la transfección.
nota: La transfección puede ser igualmente exitosa mediante la siembra de células el día de la transfección o antes del día. Usando cualquiera de las dos alternativas, el punto crítico aquí es asegurarse de que las células estén pegadas a la superficie de la placa de cultivo antes >nota: Día 2:
- transfección
- Antes de la transfección, diluya el ADN a 1 μg/μl en un tampón de ácido trisetilendiaminotetraacético (TE) que contenga 10 mM de Tris pH 8, 1 mM de EDTA pH 8 en agua desionizada.
- En un tubo de 50 ml, prepare una mezcla maestra (Tabla 2) para la transfección en el matraz T175. Agregue ADN al medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) precalentado y mezcle bien por vórtice, luego agregue polietilemina estéril (PEI) (consulte la Tabla 1 para evitar precipitaciones prematuras.
- Mezclar bien invirtiendo el tubo 3-4x, e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
- Realice un cambio de medio completo en HEK293T celdas. Aspire completamente el medio de cultivo de las células y aliméntelo con medios de cultivo HEK293T precalentados (25 ml por matraz T175).
- Agregue la mezcla de transfección (mezcla de ADN/PEI) gota a gota a las células monocapa. Mover suavemente para mezclar bien e incubar las células transfectadas a 37 °C, 5% CO2, durante la noche.
NOTA: Día 3:
- Para garantizar el éxito de la transfección, compruebe la expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP) 24 horas después de la transfección mediante microscopía fluorescente.
nota: Más del 50% de las células que expresan GFP suelen indicar una buena transfección.
nota: Día 4:
- A las 48 horas después de la transfección, recoja el sobrenadante viral y reemplácelo con medios HEK293 T frescos (25 ml por matraz T175).
- Centrifugar el sobrenadante viral a 1.140 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares del sobrenadante. Transfiera el sobrenadante aclarado a un tubo de 50 ml y guárdelo a 4 °C.
NOTA: Día 5:
- A las 72 horas después de la transfección, recoja el segundo lote de sobrenadante viral. Repita el paso 2.3.1 y agrupe los sobrenadantes limpios de 48 y 72 horas.
- Para concentrar el virus, centrifugar el sobrenadante viral a 170.000 x g durante 90 min a 4 °C utilizando tubos ultracentrífugos de 30 ml.
- Deseche el sobrenadante y repita el paso 2.6 hasta que todo el sobrenadante aclarado se haya centrifugado, dejando una bolita (invisible) de virus más PEI precipitada en la base del tubo.
- Para volver a suspender el virus, añada 500 μl de medios SATO (ver Tabla 1) a los tubos de ultracentrífuga. Agite el vórtice durante 30 segundos y raspe la base del tubo con la punta de una pipeta para aflojar mecánicamente el virus. Repita este paso 6 veces para perder la bolita viral.
- Agrupe el virus resuspendido en tubos de microcentrífuga y centrifugue muy brevemente para eliminar el PEI insoluble. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 μm para eliminar las proteínas.
- Alicuota del virus en alícuotas de 20 μl, 50 μl y 100 μl y almacene a -80 °C.
>3. Transducción de OPCs
- Cultivo de OPC primarios en medio SATO (placa de 10 ml/10 cm) con factor neurotrófico ciliar (CNTF, 10 ng/ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, 10 ng/ml), neurotrofina 3 (NT3, 1 ng/ml) y forskolina (4,2 μg/ml) a 37 °C, 8% CO2 durante 24 horas después de la disección.
- Aspire completamente el medio de cultivo OPC y alimente las células con medios SATO recién hechos (10 ml) con factores de crecimiento (ver arriba en el paso 3.1).
- Agregue el virus a los OPC hasta la concentración óptima, cultive los OPC durante 48 horas más.
>4. Siembra de OPC para cocultivos mielinizantes (Figura 2)
- Para eliminar las OPC de la superficie, primero enjuague las placas de OPC con 8 ml de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) dos veces, luego incube las células con 5 ml de tripsina-EDTA al 0,05% tibia diluida 1:10 con EBSS a 37 °C durante 2 min.
- Neutralizar la tripsina con un 30% de FBS en EBSS (5 ml) y eliminar las células de la placa mediante pipeteo. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugue a 180 x g durante 15 min en RT.
- Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en 1 ml de medios SATO precalentados seguidos de un recuento de células.
- Antes de la siembra de OPC, aspire completamente los medios de la placa de cultivo DRG. Siembre suavemente 200.000 OPC gota a gota en las neuronas DRG como se describió anteriormente.
nota: El volumen total de siembra de OPC debe ser inferior a 200 μl por cubreobjetos de 22 mm.
- Deje que las células se asienten sin mover la placa durante 10 minutos en la campana de cultivo de tejidos, luego rellene suavemente con 1 ml de medios SATO precalentados por pocillo.
- Vuelva a colocar las OPC hermanas restantes con medios SATO con factores de crecimiento (consulte el paso 6.1). Utilice estas OPC hermanas para verificar la expresión de la proteína de interés.
- Después de 24 horas, reemplace el medio SATO con el medio de cocultivo (2 ml/pocillo) que contenga medio SATO (sin factores) y neurobasal (v/v) con 1% B2Mantenga los cocultivos durante 14 días con cambio de medio cada 2-3 días.
- Evaluar los cocultivos para la expresión de proteínas de mielina mediante análisis de Western blot y visualizar la formación de segmentos axonales mielinizados mediante inmunotinción doble con anticuerpos contra marcadores de proteínas básicas de mielina y marcadores neuronales.
