Aislamiento de neuronas marcadas con fluorescencia de un cerebro murino

Resumen

Fuente: Paul, A., et al., Secuenciación de ARN de una sola célula de neuronas de ratón marcadas con fluorescencia mediante clasificación manual y transcripción doble in vitro con secuenciación de recuentos absolutos (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra un método para aislar neuronas marcadas con fluorescencia del cerebro de un ratón.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Clasificación manual de neuronas de ratón marcadas con fluorescencia

1. Tire de los microcapilares de vidrio (consulte la tabla de materiales) hasta un diámetro de salida de 10 a 15 μm utilizando un extractor de capilares con los siguientes ajustes: calor: 508, tracción: blanco, vel: blanco, tiempo: blanco.
2. Conecte un tubo de silicona flexible de 120-150 cm (~0,8 mm de diámetro interior) a un filtro de jeringa de membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,2 μm y una válvula de tubo de dos vías utilizando conectores de tubo adecuados.
3. Prepare 500 mL de líquido cefalorraquídeo artificial refrigerado (4 °C) (ACSF, Tabla 1) y oxigene burbujeando oxígeno equilibrado con dióxido de carbono al 5% a través de una piedra difusora durante 15 minutos o hasta que la solución se aclare por completo.
4. Prepare 100 mL de ACSF con un cóctel de bloqueadores de actividad en un vaso de precipitados de 150 mL (Tabla 1).
5. Prepare 100 mL de ACSF con 1 mg/mL de proteasa de la fracción IV de Streptococcus en un vaso de precipitados de 150 mL (Tabla 1).
6. Prepare 100 mL de ACSF con una solución de suero fetal bovino (FBS) al 1% en un vaso de precipitados de 150 mL y oxigene con oxígeno equilibrado con dióxido de carbono al 5% a través de una piedra difusora.
7. Diseccionar el cerebro de un ratón sacrificado abriendo el cráneo con una pequeña tijera y extrayendo el cerebro fresco con pinzas finas sin dañar la corteza><. nota: Los ratones de cualquier cepa, edad y sexo se pueden usar como se desee. No congele el cerebro ni realice una clasificación manual en ratones inyectados con virus u otros agentes peligrosos/infecciosos.
8. Mantenga el cerebro en ACSF refrigerado y oxigenado, dejando una piedra difusora unida al 5% de dióxido de carbono para equilibrar el oxígeno durante toda la duración de la sección.
9. Coloque el cerebro en el mandril del vibrátomo y corte secciones coronales o sagitales de 300 μm de grosor. Recoja tantas secciones como sea necesario para obtener un mínimo de ~ 10-50 celdas marcadas hasta varios cientos de celdas. Coloque las rodajas en un soporte para rodajas de malla de algodón, colocadas dentro de un vaso de precipitados para que se bañen en ACSF oxigenado.
10. Coloque las rodajas frescas en un vaso de precipitados que contenga ACSF con bloqueadores de actividad y bloquee durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. Siga burbujeando oxígeno con piedra aerodinámica.
11. Traslade las rodajas a un vaso de precipitados que contenga ACSF con la solución de proteasa para realizar una digestión suave a temperatura ambiente: 20-30 min para los animales P4-14 o hasta 45-60 min para los animales P28-56. Sigue burbujeando oxígeno.
12. Lave el ACSF con proteasa moviendo las rodajas de nuevo al vaso de precipitados que contiene ACSF con solución de bloqueadores de actividad durante 5-10 min a temperatura ambiente. Sigue burbujeando oxígeno.
13. Mueva las secciones individuales a una placa de Petri de 100 mm que contenga ACSF con 1% de FBS a temperatura ambiente. Bajo un endoscopio de disección fluorescente, microdisecciona áreas y capas de interés que tengan un mínimo de 10 a 50 células (hasta unos pocos cientos). Realice la microdisección con un par de pinzas finas o colocando agujas de inyección de 22 a 28 G en soportes de madera (brochetas).
14. Con una pipeta Pasteur, mueva las piezas microdisecadas a un tubo de microfuga de 2 mL que contenga ~0,8 mL de FBS al 1% en solución de ACSF.
15. Triturar el tejido diseccionado en el tubo de microfuga a temperatura ambiente. Elabore tres pipetas Pasteur de tallo largo con diámetros de salida decrecientes, enrollándolas sobre una llama abierta. Realice ~10 golpes con cada pipeta, comenzando con la más grande y terminando con la más pequeña.
16. Dispense las células disociadas en una placa de Petri de 100 mm que contenga ACSF oxigenado (la placa de Petri se puede recubrir finamente con 5 mm de agar al 1% o compuesto de silicona transparente en una proporción de 1:10, si lo desea). Mantener a temperatura ambiente.
17. Espere ~ 5-7 minutos para que las células se asienten gradualmente, luego observe la señal GFP / RFP bajo un microscopio de disección.
    nota: Las células individuales, los escombros y los pequeños grupos serán visibles en el campo claro (BF).
18. Elija de 10 a 15 células GFP/RFP a la vez utilizando una pipeta capilar (del paso 1.1) conectada a un tubo de silicona flexible (0,4 a 0,8 mm de diámetro interior) y dispense las células en una placa de Petri de 100 mm que contenga ACSF oxigenado fresco.
19. Al bloquear el extremo de la válvula de tubo con la lengüeta, coloque el capilar cerca de la celda de interés. Capture las células mediante la acción capilar al aliviar el bloqueo y vuelva a bloquearlas rápidamente para evitar que el exceso de líquido entre en la pipeta. Dispense las células en una placa de Petri de 100 mm con ACSF oxigenado fresco soplando suavemente, mientras observa la punta capilar bajo la óptica de fluorescencia del microscopio de disección. Intenta recolectar ~100-150 celdas en total.
20. Repita el paso 1.19 una o dos veces más (dependiendo de los residuos) y transfiera un total de ~50-75 celdas a una nueva placa de Petri de 100 mm, asegurándose de que los contaminantes como los escombros sean mínimos en la óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC) de campo claro.

Tabla 1: Lista de soluciones y tampones.

búfer	artículo	concentración	Cantidad (μL)
Búfer de recogida de muestras	Inhibidor de la ribonucleasa recombinante		55
	Rcc	1:50K diluido	110
	Agua libre de nucleasas		605
	Aliquot 43.75 μL de arriba en 16 tubos (2 tiras de 8; 200 μL tubos de PCR); agregue lo siguiente por tubo
	Imprimaciones UMI (p. ej., N10B1-N10B16)	1 ng/μL	6,25 μL/tubo
	Volumen final en cada tubo 50 μL (cada tubo puede dividirse en alícuotas de 25 μL y congelarse a -80 °C)
Soluciones:	artículo	concentración	importe
CSF: para hacer disolver 5 L	NaCl	126 mM	36,8 g
	Kcl	3 mM	1,15 g
	NaH2PO4	1,25 mM	0,75 g
	NaHCO3	20 mM	8,4 g
	A 500 mL de ACSF, burbujee oxígeno durante 10-15 min y luego agregue lo siguiente nuevo cada vez:
	D-glucosa	20 mM	1,8 g
	MgSO4	2 mM	0,5 mL de 4 M de culata
	CaCl2	2 mM	0,5 mL de 4 M de culata
	Mantener el ACSF oxigenado en todo momento
Soluciones:	artículo	Concentración
Cóctel bloqueador de actividad: haz un caldo 100x
	A 100 mL de ACSF añadir
	APV	0.05 mM
	CNQX	0,02 mM
	TTX	0.0001 mM (0.1 μM)
Soluciones:	artículo	importe
Solción de proteasa (100 mL)	Proteasa de Streptomyces griseus	100 mg
Suero bovino fetal: fuente comercial, alícuota en 500 μL para cada uso.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Proteasa de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
Cárgeno	Gases aéreos	Gato# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Gato# 761036
Microscopio de disección con fluorescencia e iluminación de campo claro con óptica DIC. (Leica modelo MZ-16F).	Leica	Modelo MZ-16F
Microcapilar de vidrio: Tubos capilares de borosilicato 500/pk. OD=1 mm, ID=0,58 mm, pared=0,21 mm, Longitud=150 mm.	Instrumentos Warner	Modelo GC100-15, pedido # 30-0017
Extractor de pipetas capilares	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratomo	Micro Termo	HM 650V
Unidad de enfriamiento de tejido Vibratome	Micro Termo	CU 65