>1. Recolección y cultivo de células del linaje OL (OL)
NOTA: Estos pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Al día siguiente de agitar, prepare el medio Bottenstein-Sato (BS) de acuerdo con la Tabla 1.
- Enjuague las placas de Petri recubiertas 3 veces con agua destilada estéril.
- Recolectar el sobrenadante de los matraces que contiene principalmente células del linaje OL, pero también algunas células microgliales, y colocarlo en placas de Petri de 100 mm sin recubrimiento.
nota: Este paso permite la eliminación de las células microgliales a través de una rápida adhesión diferencial en la superficie de la placa.
- Incubar las placas de Petri durante 15 min en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% deCO2.
- Llene cada matraz T150 con 25 mL de medio de cultivo caliente y recién preparado e incube en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% de CO2 hasta el segundo agitado.
- Transfiera el sobrenadante de las placas de Petri a nuevas placas de Petri de 100 mm sin recubrimiento para permitir la adhesión de las células microgliales residuales.
- Incubar las placas de Petri durante 15 min en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% deCO2.
- Retire el sobrenadante, que contiene células de linaje OL no adherentes, y transfiéralo a tubos de 50 mL (sobrenadante de 2 placas de Petri para un tubo de 50 mL). Deseche las placas de Petri cubiertas con microglía.
- Centrifugar el sobrenadante durante 5 min a 423 x g. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de medio BS. Agrupe todos los pellets en un tubo común de 50 mL y ajuste el volumen a 10 mL con medio BS.
- Determine la densidad celular contando las células bajo un microscopio.
nota: Se debe obtener una densidad celular entre 3 x 105 células/mL y 5 x 105 células/mL.
- Añadir 20 mL de BS si la densidad celular es mayor o igual a 4 x 105 células/mL para obtener un volumen final de 30 mL, o añadir sólo 10 mL de BS si la densidad celular es inferior a 4 x 105 células/mL para obtener un volumen final de 20 mL.
- Placa dos o tres placas de Petri de 100 mm prerrevestidas con 10 mL de suspensión celular. Incubar en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% de CO2.
- Limpie los residuos de las placas de Petri refrescando todo el medio BS 2 h después.
nota: Examine el cultivo bajo el microscopio antes y después de la limpieza para verificar la densidad celular y la eficiencia de la eliminación de desechos.
- Incubar durante 2 días en medio BS en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% de CO2.
nota: Examina el cultivo bajo el microscopio. La confluencia debe ser del 70% al 80%.
>2. Producción OCM
NOTA: Realice estos pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Prepare el medio NB-B27low de acuerdo con la Tabla 2.
- Renueve el medio de cultivo con 10 mL de medio NB-B27low tibio. Incubar durante 2 días en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% de CO2.
- Cosecha el OCM, es decir, el sobrenadante que contiene los factores secretados por OL. Filtre-esterilice OCM utilizando un filtro de 0,22 μm.
nota: Almacene OCM a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
Tabla 1: Preparación de los medios Bottenstein-Sato (BS).
| Medios de comunicación de Bottenstein-Sato (BS) | Concentración final |
| Dulbecco's Modified Eagle Medio | |
| Penicilina-Estreptomicina | 100 UI/mL |
| apo-Transferrina humana | 100 μg/mL |
| BSA (Albúmina sérica bovina) | 100 μg/mL |
| insulina | 5 μg/mL |
| PDGF | 10 ng/mL |
| progesterona | 62 ng/mL |
| Dihidrocloruro de putrescina | 16 μg/mL |
| Selenito de sodio | 40 ng/mL |
| T3 (sal sódica de 3,3',5-Triyodo-L-tironina) | 30 ng/mL |
| T4 (L-tiroxina) | 40 ng/mL |
Tabla 2: Preparación de los medios NB-B27low y NB-B27.
| NB-B27 medios bajos | Concentración final |
| Neurobasal | |
| Suplemento de B27 | 0.5x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicilina-Estreptomicina | 100 UI/mL |
| Medios NB-B27 | Concentración final |
| Neurobasal | |
| Suplemento de B27 | 1 vez |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicilina-Estreptomicina | 100 UI/mL |
