- Cultivo compartimentado de ganglios de raíz dorsal de rata (DRG), oligodendrocitos (OPC) y hGC (células de glioma humano)
1. Preparación de platos de cultivo compartimentados
NOTA: Realice los siguientes pasos los días antes de la cosecha planificada de los DRG.
- Ensamble platos de cultivo compartimentados.
- Diluir la solución madre de colágeno a 500 μg/mL en H2O destilado estéril; mezclar bien.
- Con una pipeta de transferencia estéril, llene una placa de cultivo de 35 mm con 2 ml de solución de colágeno; retire la solución, dejando una fina película de colágeno, y colóquela en la siguiente placa de 35 mm. Repita este proceso, agregando más solución de colágeno según sea necesario, hasta que todos los platos estén cubiertos.
- Una vez que todas las placas estén cubiertas, colóquelas en una bandeja de cultivo de 245 mm x 245 mm y coloque tres gasas de 1 mm x 1 mm en el centro de la bandeja.
- Para polimerizar el colágeno, humedecer las gasas con 1 mL de hidróxido de amonio concentrado y cubrir las bandejas durante 15 min.
- Retire las gasas y deje que los platos de 35 mm se sequen en la campana de flujo laminar.
- Mientras se secan los platos, cargue el cilindro del aplicador de grasa de la jeringa con grasa de alto vacío. Coloque las cámaras compartimentadas en una botella de medios de boca grande llena de agua destilada. Esterilizar ambos en autoclave y dejar enfriar.
- Lime la punta de una aguja de 18 G para hacer una punta roma. Esterilizar en etanol al 70%. Coloque la aguja en la jeringa de grasa.
- Esterilice el rastrillo de púas sumergiéndolo en etanol al 70%; deje que se seque al aire en la campana de flujo laminar.
- Retire la tapa de un plato seco de 35 mm recubierto de colágeno. Sostenga el plato entre el pulgar y el índice. Sostenga el rastrillo de alfileres con la otra mano. Aplique una presión firme para crear arañazos de hasta 200 μm de ancho en el centro del plato.
- Con una pipeta de pasto, coloque dos gotas de Neuronal Basal Medium Suplementado en el centro de los rasguños.
- Repita los pasos 1.1.10-1.1.11 hasta que se hayan rayado todos los platos.
- Seque las cámaras compartimentadas en una campana de flujo laminar.
- Con pinzas hemostáticas estériles, sujete una cámara compartimentada por el divisor central. Voltee las pinzas hemostáticas para que la parte inferior de la cámara quede hacia arriba.
- Aplique grasa de silicona a la cámara compartimentada, comenzando por la parte superior. Asegúrese de que la grasa esté colocada de forma ordenada y se superponga en todas las esquinas.
- Retire la tapa de un plato de 35 mm. Invierta el plato y coloque los arañazos sobre la cámara. Golpee suavemente la parte inferior de la placa con un par de pinzas.
- Voltee suavemente la placa con las pinzas hemostáticas. Suelte las pinzas.
- Coloque un montículo de grasa en la base del compartimento central. Llene cada cámara con medio basal neuronal (NB) suplementado y compruebe si hay fugas. Selle las fugas con grasa de silicona según sea necesario.
- Continúe ensamblando todos los platos de cultivo y almacene durante la noche a 37 ° C, 5% de CO2.
