Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de soluciones y materiales
- Prepare la solución de Ringer mezclando 123,3 mM de NaCl, 1,53 mM de CaCl2, 4,96 mM de KCl, 0,809 mM de Na2HPO4 y 0,147 mM de KH2PO4 (ver Tabla de Materiales). Ajuste el pH a 7,4 y filtre la esterilización en botellas de 100 ml. Almacene en un lugar limpio y seco. No lave los frascos con jabón (trátelos como cristalería de cultivo de tejidos).
- Preparar 1 mg/mL de solución madre de fibronectina (FN) (ver Tabla de Materiales) disolviendo FN en solución estéril de Ringer y almacenar en alícuotas de 100 μL a -80 °C (estable durante al menos 4 años).
- Prepare medios de cultivo completos complementando los medios L15 con 0,8 % de L-glutamina, 0,08 % de penicilina/estreptomicina, 10 % de FBS y 10 % de extracto de embrión de pollo. Cree alícuotas de 3 mL y almacene a -20 °C o -80 °C.
nota: Si los cultivos se incuban en una incubadora de CO2, el medio Eagle Modified Eagle F12 (DMEM/F12) de Dulbecco debe sustituirse por L15, que se amortigua para el aire.
- Prepare marcos de soporte de papel de filtro (rectángulos de papel de aproximadamente 1 cm x 1,5 cm con dos o tres orificios perforados superpuestos en el eje largo).
- Perfore agujeros a lo largo del borde de un trozo grande de papel de filtro con un punzón estándar de tres orificios, corte/recorte el borde perforado en una tira y luego corte la tira entre los agujeros en rectángulos de ~ 1,5 cm de longitud. Papeles de filtro de autoclave antes de usar (opcional).
- Reúna herramientas de disección, como pinzas finas # 4, pinzas romas, tijeras de disección, tijeras de resorte y agujas de tungsteno afiladas.
>2. Preparación de platos de cultivo
- Seleccione placas de cultivo de pliegues neuronales (consulte la Tabla de materiales) apropiadas para la aplicación posterior.
- En el caso de los cultivos que se van a fijar y teñir, utilice cubreobjetos de vidrio colocados en placas de cultivo de tejidos de varios pocillos.
nota: Los cubreobjetos que coinciden con el tamaño del pocillo se moverán menos con la mezcla de fluidos, lo que hace que sea menos probable que los explantes se desplacen y que se adhieran al cubreobjetos en lugar del fondo del plato.
- Seleccione platos de cámara simple o de cámara dividida con fondo de vidrio (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes en vivo con un microscopio invertido.
- Para obtener imágenes en vivo en un microscopio vertical o estereoscópico, utilice placas de cultivo de tejidos ópticamente apropiadas de 6, 12 o 24 pocillos.
- Seleccione placas de cultivo de tejidos de plástico para la recolección masiva de células de cresta neural migratoria para análisis de alto rendimiento.
- Agregue 10 U/mL de penicilina y 10 μg/mL de estreptomicina a un frasco de 100 mL de solución estéril de Ringer (por ejemplo, 100 μL de penicilina de 10,000 U/mL y 10,000 μg/mL de estreptomicina, para producir P/S de Ringer). Utilice el P/S de Ringer en 1 semana.
- Descongele una alícuota de 1 mg/mL de FN en hielo. Diluir con P/S de Ringer hasta una concentración de 10-100 μg/mL de FN.
- Pipete suficiente solución de FN para cubrir el fondo del pocillo o plato. Por ejemplo, 100 μL por pocillo en una placa de 24 pocillos, 500 μL para una placa de 35 mm.
- Vuelva a colocar la tapa e incube los platos o placas con solución FN en una incubadora humidificada (o una bandeja cubierta con toallas de papel empapadas en agua destilada) a 38 °C (100 °F) durante al menos 1 h mientras disecciona los pliegues neuronales.
>3. Disección de pliegues neuronales
- Transfiera un embrión a un plato limpio que contenga la solución P/S de Ringer y enjuague el embrión sosteniendo el marco de papel de filtro con pinzas y agitando suavemente hacia adelante y hacia atrás para eliminar cualquier yema que oscurezca la vista del embrión. Cambie el P/S del Ringer o transfiéralo a un plato fresco si se pone turbio.
- Coloque el embrión con el lado dorsal/marco hacia arriba bajo un microscopio de disección. Dejando el embrión en el marco de papel para mantenerlo estirado y en su lugar, retire la membrana vitelina con pinzas para exponer los pliegues neurales.
nota: Si el embrión se cae del marco de papel, se puede colocar plano en el plato o fijarlo a un plato recubierto de sylgard para su disección.
- Con unas tijeras de resorte o una aguja de tungsteno afilada, extirpe con cuidado los pliegues neurales del mesencéfalo. Incluya el tejido caudal a las vesículas ópticas en expansión y el rostral al cerebro posterior, donde las constricciones de los rombomeros están comenzando a aparecer (la media luna cardíaca también es un indicador útil, Figura 1B, C). Tenga cuidado de extirpar la cara más dorsal del pliegue neural con un mínimo de contaminación del tubo neural y el ectodermo no neural (Figura 1C).
- Transfiera los pliegues neuronales a un plato limpio que contenga P/S de Ringer utilizando una pipeta P20 o una pipeta Pasteur de vidrio estéril enjuagada con P/S de Ringer yema (esto bloquea el plástico o el vidrio para evitar que el tejido se pegue). Guarde los pliegues recolectados en hielo mientras disecciona los pliegues adicionales.
>4. Recubrimiento de pliegues neuronales
- Descongelar una alícuota de medios de cultivo completos (sección 1, paso 3). Añadir 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina y esterilizar con filtro. Mantenga los medios preparados a 37-38 °C mientras realiza otros pasos.
- Retire las placas de cultivo de la incubadora (sección 2, paso 5). Con una pipeta o una pipeta Pasteur, retire la solución FN de los cubreobjetos, platos o pocillos. Después de enjuagar el sustrato recubierto de FN con P/S de Ringer, agregue un volumen adecuado de medio de cultivo completo a las placas o pocillos (500 μL para pocillos en una placa de 24 pocillos, 2 mL para una placa de 35 mm o una placa de seis pocillos)
nota: Los volúmenes más pequeños pueden conservar reactivos costosos (por ejemplo, tan solo 200 μL para una placa de 24 pocillos), pero garantizan que la placa esté lo suficientemente humidificada para evitar la evaporación.
- Con una pipeta p20 o p200, primero enjuague la punta de la pipeta con Yolky Ringer's P/S para bloquear el plástico y evitar que el tejido se pegue. A continuación, transfiera los pliegues neuronales aislados a los cubreobjetos recubiertos de FN, teniendo cuidado de transferir la menor cantidad posible de P/S de Ringer. Coloque los pliegues hacia el centro del cubreobjetos recubierto de FN.
nota: Se pueden revestir uno o varios pliegues neuronales en un cubreobjetos de 12 mm en un pocillo de 19 mm, hasta 50 en una placa de 35 mm.
- Después de dejar que los explantes se asienten durante 10-15 minutos, colóquelos en una cámara humidificada a 38 °C (100 °F) llevando lenta y cuidadosamente las placas de cultivo con pliegues neuronales plateados. Esto minimizará el desplazamiento de los pliegues neuronales en los pozos, asegurando que permanezcan dispersos y se adhieran a cualquier cubreobjetos><.
nota: Cuando se usa L15 (no DMEM), las placas de cultivo de explantes también se pueden incubar en una incubadora de huevos usando una bandeja cubierta con toallas de papel humedecidas.
- Incubar cultivos de pliegues neurales en la incubadora humidificada durante la duración de la migración activa (alrededor de 16-20 h en total, Figura 2).
