Aislamiento de neuronas ganglionares vestibulares del oído interno de un ratón

Resumen

Fuente: Iyer, M. R. et al., Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp.J. Vis. Exp. (2023).

Este video muestra un método para aislar neuronas vestibulares del oído interno de un cachorro de ratón. Describe meticulosamente los pasos involucrados en la disección del oído interno, la recolección del ganglio vestibular y, posteriormente, la disociación del ganglio en células individuales. A continuación, estas células se cultivan en placas con fondo de cristal para establecer un cultivo de neuronas vestibulares.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparativos

NOTA: Las soluciones y herramientas descritas en esta sección pueden elaborarse con mucha antelación y utilizarse el día de la disección y el registro.

1. Prepare medios Liebovitz suplementados con 10 mM HEPES (solución L-15). Los siguientes pasos describen la preparación de 1 L de solución de L-15.
   1. Vierta 990 mL de H₂O desionizado en un vaso de precipitados. Mida y agregue 2.386 g (10 mM) de HE....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suplemento B27 (50x), sin sérum	Thermo Fisher Scientific	17504044	aditivo al medio de cultivo, para SGN
Vaso de precipitados (1000, 100, 10) mililitro
centrífuga de sobremesa	Científico de EE. UU	2641-0016
Mechero de bunsen
colagenasa	Sigma-Aldrich	C5318	Una de cada tres enzimas para digerir el tejido
Cubreobjetos, rectangular, #1 de grosor, 22x40	Instrumentos Warner	64-0707
Dmso	Biotio	90082
Dnasa I, de páncreas bovino	Sigma-Aldrich	11284932001	Una de cada tres enzimas para digerir el tejido
Pinzas Dumont #3 (romas)	Herramientas de Bellas Ciencias	11231-30
Pinzas Dumont #5 (finas)	Herramientas de Bellas Ciencias	11251-10
Pinzas Dumont #55 (finas)	Herramientas de Bellas Ciencias	11255-20
etanol	Laboratorios de descontaminación	Año 2716	para la limpieza del cabezal y alrededor del banco de disección
Capilares de borosilicato filamentado para electrodos	Instrumentos Sutter	BF140-117-10
Cuchilla de disección de filo fino	Herramientas de Bellas Ciencias	10010-00
Pipetas Pasteur de vidrio	VWR	14673-010	para tirar de pipetas de trituración
Suero fetal bovino inactivado por calor	Thermo Fisher Scientific	16140063	aditivo al medio de cultivo
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	para tampón de pH de todas las soluciones del protocolo
Placa calefactora / agitadores magnéticos	VWR	76549-914
Cubo aislado lleno de hielo			para mantener todas las muestras y soluciones frías
Tijeras de resorte grandes	Herramientas de Bellas Ciencias	14133-13
Leibovitz medio	Sigma Aldrich	L4386	Soluciones de disección y baño
Cámara de grabación de baño de bajo perfil para placas de cultivo	Instrumentos Warner	64-0236
Jeringas Luer-Lok, 30 ml	Bd	302832	para dibujar la solución L-15/HEPES/HEPES.
Suplemento MEM + Glutamax	Fisher Científico	41-090-101	Base del medio de cultivo
Aguja microFil para el llenado de micropipetas - calibre 34	Instrumentos de precisión mundial	MF34G
Suplemento N2 (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502-048	aditivo para el medio de cultivo, para SGN
NaOH (1 M)	Thomas Científico	319511-500ML	para la valoración del pH
Oxígeno, grado médico, con regulador y tubo adecuados	Gestión de materiales de la USC	MEDOX200 (Identificador: 00015)	para disolver en soluciones de disección y baño
Parafilm	Bemis	PM992
Bulbo de pipeta Pasteur (3 ml)	Fisher Científico	03-448-25	Bombilla para pipetas de trituración
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Aditivo para evitar la contaminación del medio de cultivo
Solución de eutanasia a base de pentobarbital (p. ej., Fatal Plus. dosis de 50 a 60 mg/kg)	MWI Sanidad Animal	Año 15199	para la eutanasia
Filtros de membrana PES, 0,2 micrómetros	Nalgene	566-0020	para soluciones de filtrado
Filtros de jeringa estériles con membrana PES, 0,22 mmm, 30 mm	CELLTREAT	229747	para filtrar soluciones introducidas en jeringas
Placas de Petri, 35 x 10 mm	Genessee Científico	32-103	para microdisección y para retener la solución de inmersión de la punta en configuración de parche perforado
Placas de Petri, 60 x 15 mm	Científico de Midland	P7455	para disección macroscópica
Medidor de pH	Mettler Toledo	Modelo S20
Pipettors (1000, 200, 10) microlitro	Científico de EE. UU
Placa de cultivo con fondo de vidrio recubierta de poli-d-lisina	Mattek	P35GC-0-10-C	para placas de neuronas para cultivo
Plataforma de cambio rápido, base calefactada, para placas de cultivo de 35 mm	Instrumentos Warner	64-0375
Celda de referencia	Instrumentos de precisión mundial	RC1T
Hoja de bisturí	Miltex	4-315
Mango de bisturí	Herramientas de Bellas Ciencias	10003-12
Escala Científica	Mettler Toledo	XS64
Pipetas serológicas (10, 25) mililitros	Fisher Científico
Kit de grasa de silicona (para sellar el cubreobjetos y la cámara)	Instrumentos Warner	64-0378
Guillotina para animales pequeños	Kent Científico	DCAP
Guillotina de animales pequeños	Kent Científico	DCAP	para la decapitación si se diseccionan ratas mayores de P15.
Microscopio estereoscópico de disección	Zeiss	Stemi 2000
Tijeras quirúrgicas rectas	Herramientas de Bellas Ciencias	14060-09
Jeringa (3, 10, 30) mililitro
tripsina	Sigma Aldrich	T1426	Una de cada tres enzimas para digerir el tejido
Jeringa de tuberculina	Covidien	8881500105	para la administración de solución de eutanasia por inyección intraperitoneal
Tijera de resorte Vannas, filo de corte de 2,5 mm	Herramientas de Bellas Ciencias	15000-08
Matraz aforado, 1000 mililitros
vórtice	VWR	945300
Agua, estéril, R>18.18 megaOhms cm (por ejemplo, filtrada por un sistema de purificación de agua Millipore-Sigma)	Millipore-Sigma	CDUFBI001

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