Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparativos
NOTA: Las soluciones y herramientas descritas en esta sección pueden elaborarse con mucha antelación y utilizarse el día de la disección y el registro.
- Prepare medios Liebovitz suplementados con 10 mM HEPES (solución L-15). Los siguientes pasos describen la preparación de 1 L de solución de L-15.
- Vierta 990 mL de H2O desionizado en un vaso de precipitados. Mida y agregue 2.386 g (10 mM) de HEPES. Agregue una botella de 1 L de polvo de solución L-15.
NOTA: El L-15 en polvo tiene una vida útil más larga y ocupa menos espacio de almacenamiento. Alternativamente, compre una solución de L-15 y complemente con HEPES. Esta última opción también tiene la opción de utilizar una solución sin fenol, que es útil para la obtención de imágenes de fluorescencia.
- Revuelva la solución en una placa para revolver. Con un medidor de pH, agregue lentamente hidróxido de sodio (NaOH) 1 N para obtener un pH entre 7,34 y 7,36.
- Añadir H2O desionizado hasta que la solución alcance un volumen de 1.000 mL. Filtre la solución con una membrana de 0,22 μm de tamaño de poro.
nota: La solución de L-15 puede almacenarse a 4 °C durante 1-2 semanas. Si se usa L-15 hecho con rojo fenol, la solución se volverá rosa si es demasiado básica (pH > 7.4) o naranja si es demasiado ácida (pH < 7.34).
- Preparar el medio de cultivo para las neuronas ganglionares vestibulares (VGN). Siga los pasos a continuación para hacer 50 mL de medio de cultivo:
- Añada 47,5 ml de medio esencial mínimo GluMAX-I a un vaso de precipitados de vidrio limpio.
- Mida y agregue 0,1194 g (10 mM) de HEPES. Este tampón adicional resiste los cambios de pH mientras las células se asientan antes de ser trasladadas a la incubadora.
- Añadir 2,5 mL de suero fetal bovino (FBS). Esto hace un 5% en volumen de FBS en un volumen total de 50 mL de medio.
- Revuelva la solución en una placa para revolver. Con un medidor de pH, agregue lentamente 1 N NaOH para obtener un pH entre 7.38 y 7.4.
- Añadir 0,5 mL de penicilina-estreptomicina. Filtre la solución a través de un filtro estéril de 0,22 μm. Almacene la solución a 4 °C.
- Al menos 30 minutos antes de usar, transfiera el medio de cultivo a un matraz de cultivo de tejidos con tapa ventilada. Colocar el matraz con los medios de cultivo en una incubadora con una concentración de CO2 del 5% a 37 °C.
>2. Fabricación de pipetas de trituración
NOTA: Las pipetas de trituración se pueden reutilizar para múltiples experimentos. Enjuague las pipetas con etanol, agua y solución L-15 antes de cada uso y límpielas con agua y etanol después de cada uso. Almacene con cuidado entre usos.
- Para preparar pipetas de trituración para la disociación celular, sostenga una pipeta Pasteur de vidrio frente a la llama de un mechero Bunsen. Una vez que la punta del vidrio comience a derretirse, estírelo hasta el diámetro deseado. Separe un extremo de la pipeta de la llama para crear una pequeña curva.
- Acerque la pipeta doblada a un microscopio. Con una baldosa de incisión, marque y rompa el vidrio al diámetro deseado.
- Pase la punta de la pipeta por encima de la llama del mechero Bunsen. Esto pulirá rápidamente los bordes ásperos cerca de la punta. Verifique que la punta no esté sellada por la llama.
- Repita el proceso hasta que se hayan preparado cuatro o cinco pipetas de diferentes tamaños.
>3. Extracción del ganglio vestibular y placa de las neuronas vestibulares
- Preparación para la disección
- Prepare una mezcla enzimática de solución de L-15 con 0,05% de colagenasa y 0,25% de tripsina. Por ejemplo, agregue 0,001 g de colagenasa y 0,005 g de tripsina a 2 ml de solución de L-15 en un vaso de precipitados, agregue un pequeño agitador magnético y revuelva hasta que esté completamente mezclado. Dejar a un lado a temperatura ambiente.
- Prepare una guillotina obtenida comercialmente colocando toallas de papel a un lado y debajo de la guillotina para minimizar la exposición de la mesa de trabajo y otras superficies a la sangre y otros materiales biológicos.
- Coloca tijeras grandes de acero inoxidable, pinzas grandes y tijeras de resorte grandes. Tenga a mano una botella rociadora grande con etanol al 70% para limpiar la cabeza.
- Llene un vaso de precipitados de 100 ml con solución L-15 y colóquelo sobre hielo. Oxigenar la solución de L-15.
- Coloque las tijeras de resorte, las tijeras quirúrgicas, las pinzas, el bisturí y la pipeta de transferencia (consulte la tabla de materiales).
- Prepare una placa de Petri de 60 mm (para la disección macroscópica) y dos placas de Petri de 35 mm (para la limpieza/disección fina de los ganglios). Llene el plato de 60 mm con solución de L-15 oxigenada utilizando una jeringa de 30 ml con una punta de filtro de 0,22 μm.
- Eutanasia, limpieza de la cabeza y hemisección
- Pesar las crías para calcular la dosis adecuada de dilución fatal-plus para administrar por vía intraperitoneal (~0,01 ml por 10 g).
- Una vez que se alcanza un plano profundo de anestesia, evaluado por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, decapitar con la guillotina.
- Enjuague bien la cabeza con etanol al 70% y luego abundantemente con solución L-15.
- Retira completamente la piel del cráneo. Disecciona la cabeza con unas tijeras de resorte grandes comenzando en el punto de entrada de la médula espinal al cerebro y haciendo dos cortes, el primero a través de la parte superior del cráneo y el segundo a través de la parte inferior de la mandíbula. Termine de dividir la cabeza con unas tijeras quirúrgicas.
- Coloque ambas mitades de la cabeza, con el cerebro hacia abajo, en una placa de Petri de 60 mm llena de solución L-15. Coloque el tejido fresco que no se está diseccionando actualmente sobre hielo.
- Extracción del ganglio vestibular superior
- Saque el cerebro con unas tijeras quirúrgicas cerradas. Cortar y extirpar el nervio craneal para separar completamente el cerebro del cráneo.
nota: En este punto, la cápsula ótica (con forma de número 8) debe ser visible en la parte posterior de la cabeza.
- Con pinzas y comenzando en la parte posterior de la cabeza, retire el material membranoso transparente.
- Corta la parte superior del cráneo con unas tijeras quirúrgicas. Retire el exceso de tejido de la parte posterior de la cabeza y el cuello para que el área de disección y la cápsula ótica estén más limpios y sean más fáciles de acceder><.
nota: Evite enturbiar demasiado el plato desechando el exceso de tejido durante todo el procedimiento.
- Transfiera el tejido a una segunda placa de Petri con una solución fresca de L-15. Localiza la cápsula ótica y los nervios auditivo, vestibular superior e vestibular inferior. Corte el nervio auditivo y separe los ganglios superior e inferior con unas tijeras de resorte pequeñas.
nota: Aunque los somas del nervio vestibular se encuentran tanto en los ganglios inferiores (más delgados) como en los superiores (más gruesos), las células extraídas del ganglio superior tienen una mejor supervivencia.
- Con un bisturí, afeita suavemente la cresta ósea para debilitar el área ósea debajo de la cual el nervio se sumerge en la cápsula ósea. Retire cuidadosamente los residuos con pinzas finas, exponiendo toda la parte inflamada del ganglio.
- Use las tijeras de resorte finas para cortar y separar el ganglio de la rama del nervio periférico que se sumerge hacia el utrículo.
- Retire el ganglio superior con pinzas finas, asegurándose de no pellizcar demasiado cerca del tejido ganglionar. Transfiera a una placa de Petri de 35 mm con solución fresca de L-15.
- Antes de continuar, precalentar la solución de enzimas: verter la mezcla de enzimas en una placa de Petri de 35 mm y colocar en una incubadora a 37 °C durante 10-15 min.
- Limpie el ganglio con pinzas finas y tijeras de resorte pequeñas eliminando el hueso (que parece blanco y cristalizado en estructura), el exceso de tejido, las fibras nerviosas y cualquier otra estructura superflua. Tenga cuidado de minimizar la eliminación de cualquier tejido ganglionar.
- Disociación de tejidos y placas.
- Transfiera los ganglios limpios a la solución enzimática precalentada y colóquela nuevamente en la incubadora durante 10 a 40 minutos. El tratamiento enzimático se completa una vez que el tejido comienza a romperse, pero permanece en una sola pieza. El tratamiento excesivo del tejido con enzimas dará como resultado la disolución completa de los ganglios antes de la trituración.
NOTA: La cantidad de tiempo que el tejido se somete a un tratamiento enzimático depende de la edad del animal. Por ejemplo, los ganglios de las ratas P9 se tratan con enzimas durante 25 min, y los ganglios de las ratas P15 se tratan con enzimas durante 35 min.
- Transfiera los ganglios a la placa de Petri de 35 mm con solución fresca de L-15 e incube durante 2-3 minutos.
- Transfiera los ganglios a otra placa de Petri de 35 mm llena de medios de cultivo filtrados.
- Con una micropipeta de 200 μL, pipetee una gota de ~150 μL de medio de cultivo filtrado en una placa con fondo de vidrio recubierto. No agregue demasiada solución, ya que es importante mantener la tensión superficial para formar una burbuja de solución que permanezca sobre el cubreobjetos de vidrio.
- Transfiera el número deseado de ganglios (de uno a cuatro) al cubreobjetos.
- Extraiga una pequeña cantidad de medio de cultivo de la placa de cultivo para enjuagar la pipeta de trituración con medio para evitar que el tejido se pegue a los lados de la pipeta de vidrio. Triturar pasando suave y repetidamente el tejido a través de la pipeta hasta que los ganglios estén suficientemente disociados.
nota: No trabaje demasiado el tejido para intentar suspensiones unicelulares ni permita que las células se estrellen contra el fondo del plato utilizando una presión positiva excesiva. Además, evite formar burbujas de aire, ya que esto reducirá la supervivencia de las células. La trituración suave es la clave para lograr una supervivencia celular exitosa.
- Deje reposar las células durante 5 min. Revise bajo un microscopio óptico para ver si las células se han asentado en el cubreobjetos.
- Coloque con cuidado una placa de cultivo en una incubadora a 37 °C durante 12-24 h. Nuevamente, asegúrese de mantener intacta la burbuja de solución.
nota: Cuando se cultive durante más de 24 horas, refresque el medio de cultivo a diario. Este puede ser un posible punto de pausa.
