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>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Disociación tisular
NOTA: Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un cultivo de tejido estéril designado como cabina de bioseguridad utilizando técnica aséptica y materiales estériles.
- Agregue 1 mL de tripsina al 0.05% que contenga 0.53 mM de EDTA a cada tubo cónico de 15 mL de DMEM de 9 mL y tejido para comenzar la lisis tisular.
nota: El DMEM contiene una gran cantidad de cloruro de calcio, que puede actuar como inhibidor de la tripsina. Si la disociación no se completa siguiendo los pasos descritos, se puede utilizar la solución salina equilibrada de Hanks sin calcio ni magnesio. Después de la tripsinización, la enzima puede neutralizarse añadiendo un inhibidor de la tripsina, aunque el calcio debe añadirse de nuevo a la solución, ya que es un cofactor de la DNasa I, que se utiliza en los pasos posteriores.
- Triturar con una pipeta de 10 mL aproximadamente 20x.
- Transfiera las suspensiones celulares a tubos cónicos vacíos de 50 mL.
- Incubar la solución a 37 °C, 5% de CO2 durante 15 min, agitando suavemente los lisados después de 8 min.
- Agregue 5 mL de MGM y 200 μL (5 mg/mL) de DNasa I a cada tubo para obtener una concentración final de 50 μg/mL.
- Triturar cada lisado con una pipeta de 10 mL 10x.
- Deje reposar las suspensiones celulares durante 3 minutos a temperatura ambiente para permitir que el tejido no disociado se asiente en el fondo de los tubos.
- Transfiera las suspensiones celulares a nuevos tubos cónicos de 50 mL, dejando atrás el tejido no disociado.
nota: Los pasos de lisis y trituración descritos anteriormente limitan significativamente la cantidad de tejido no disociado.
- Centrifugar los tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sin freno.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos celulares restantes en 5 mL de MGM.
- Triturar el pellet con una pipeta de 5 mL 20x.
- Coloque las suspensiones de celdas de 5 mL en matraces T25 recubiertos.
- Incubar las células a 37 °C, 5% de CO2 y cambiar el medio inicialmente después de 24 h para eliminar los restos celulares.
nota: Algunos protocolos recomiendan un cambio inicial de medio después de 72 h. Es posible que sea necesario optimizar este paso.
- Realice un cambio de medio del 100% con MGM cada 48-72 h hasta que las celdas estén confluentes en un 80% (aproximadamente 5-7 días).
NOTA: Todos los medios deben calentarse a 37 °C antes de cambiar de medio.
>2. Aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos
Al enchapar OPC después del aislamiento inicial, deben recubrirse sobre una superficie recubierta de poli-D-lisina (placa estéril o cubreobjetos). Prepare estos materiales antes de completar esta sección.
- Después de 15 h de agitación, retire el sobrenadante de los matraces y póngalo en una placa de Petri estéril de 100 mm.
- Incubar el sobrenadante a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 min, agitando después de 15 min para eliminar las microglías restantes, ya que éstas se adherirán muy rápidamente a la placa. Para este paso se pueden utilizar placas de Petri tratadas con cultivo de tejidos.
- Retire el sobrenadante celular no adherente, el recuento y la placa sobre una superficie recubierta de poli-D-lisina. Normalmente, se chapan entre 7.500 y 10.000 OPC/cm2.
- Incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante al menos 1 h (hasta 6 h), luego aspirar suavemente el 95% del medio y agregar lentamente el medio OPC tibio, pipeteando el medio contra la pared del pocillo para minimizar la interrupción de los OPC. Cambie el medio cada 48 h hasta que las celdas estén listas para su uso.
NOTA: Es fundamental que solo se cambie un pozo a la vez. Los OPC son sensibles y son especialmente intolerantes a las condiciones secas. La adición de PDGF-AA en medios OPC es para retrasar la maduración de OPC en oligodendrocitos. Este factor puede excluirse de los medios de cultivo si el foco experimental son oligodendrocitos maduros.
Tabla 1: Recetas de búfer y medios.
Glia Media Mixta (MGM)
| 88 mL | 1X DMEM (alto contenido de glucosa, con L-glutamina, con piruvato de Na) |
| 10 mL | FBS inactivado por calor |
| 1.0 mL | L-Glutamina (100X) |
| 1.0 mL | Antibiótico/Antimicótico |
OPC Medios (50mL)
| 49 mL | Medios neurobasales |
| 1.0 mL | Suplemento de B27 (50X) |
| 10 ng/ml | PDGF-AA |
| NOTA: PDGF-AA se añade de nuevo antes de cada cambio de medio. |