Una técnica para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas

Resumen

Fuente: Boisvert, E. M., et al. Un método estático autodirigido para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas. J. Vis. Exp (2020).

Este video muestra una técnica para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs). El cultivo adherente de las colonias de hESC se trata con enzimas para separarlas y romperlas en grupos. Estos grupos forman esferas tridimensionales en suspensión, que luego son inducidas a diferenciarse en organoides que imitan la corteza cerebral con capas de neuronas y células gliales.

Protocolo

>1. Mantenimiento de células madre

1. Mantenga las hESC H9 en una capa de matriz de membrana basal reducida en factor de crecimiento (consulte la Tabla de materiales, en adelante simplemente denominada matriz) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Para recubrir una placa de 6 pocillos o una placa de 10 cm, combine 100 μL de matriz con 5,9 mL de medio Eagle modificado (DMEM)/F12 de Dulbecco helado. Envuelva las placas en una película de parafina y guárdelas durante la noche a 4 °C. Utilícelas al día siguiente para pasar las células después de aspirar el exceso de matriz/medio.
2. Cultive las células semana a semana en una proporción de división de aproximadamente 1:12 cada 7 días. Mantenga las células utilizando medios mTESR-1 en una incubadora a 37 °C, con bajo contenido de oxígeno (5% O₂, 5% CO₂). Actualice los medios a diario. Elimine las células diferenciadoras del cultivo entre los pasajes utilizando herramientas de vidrio.
3. Las células H9 deben pasar de cuatro a seis días antes de utilizarlas para producir organoides. Las células deben pasarse en una proporción aproximada de 1:8 de los grupos de células. Para hacer esto, comience enjuagando las células con el medio de mezcla de nutrientes Eagle modificado F-12 (DMEM / F12) de Dulbecco y disocie las células con una proteasa neutra (por ejemplo, dispasa, en adelante denominada simplemente proteasa), enjuague con DMEM / F-12 y coloque una placa como 30-60 grupos de células en 4 placas (6 pocillos o 10 cm) con una confluencia de ~ 20%. Dos días antes de la cosecha, transiétalos a una incubadora regular (21% O₂, 5% CO₂). Las placas deben alcanzar ~80% de confluencia al comenzar la formación de organoides.

>2. Disociación de las hESCs para el cultivo de organoides

1. Alícuota la solución madre de proteasa (5 U/mL).
   nota: Por lo general, congelamos alícuotas de 1 ml a -20 °C para su uso durante varios meses.
2. Diluir la solución madre de proteasa hasta la concentración de trabajo añadiendo 1 mL de la solución madre más 5 mL de DMEM/F12 por cada placa de 6 pocillos o 10 cm de hESCs.
3. Aspire y retire los medios de cultivo celular, luego cubra las hESC con la solución de proteasa. Coloque las placas en la incubadora durante 10-15 minutos o hasta que los bordes de las colonias se redondeen y comiencen a separarse de la matriz.
4. Incline la placa, aspire la solución de proteasa y lave suavemente las células con DMEM/F12 tres veces. Use 2 mL/pocillo para cada lavado cuando use una placa de 6 pocillos y 6 mL cuando use una placa de 10 cm. Asegúrese de que las colonias permanezcan adheridas a la matriz al realizar este paso.
5. Vuelva a añadir aproximadamente 1,5 mL de medio mTESR fresco a cada pocillo (o 5 mL para una placa de 10 cm) y enjuague las células de la placa con un pipeteo suave.
6. Con una pipeta de 10 ml, aspire y dispense suavemente hESC dentro de la placa hasta que alcancen aproximadamente 1/30 de su tamaño original. Los grupos de colonias deben parecerse a cuadrados de ~250-350 μm al completar estos pasos.

>3. Generación de organoides

1. Transfiera las células a un único matraz T75 de fijación ultra baja que contenga 30 mL de medio mTESR sin factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF).
2. Al día siguiente, incline el (los) matraz (s) de manera que las células vivas se acumulen en la esquina (esto puede tomar de 5 a 10 minutos el primer día, pero se volverá más rápido a medida que los grupos se hagan más grandes).
   nota: Si hay un gran número de células que se han adherido al fondo del matraz en este paso o en cualquier paso posterior, transfiera las células a un nuevo matraz. Es normal tener una alta población de células muertas durante los dos primeros días. Al realizar cambios de medios, asegúrese de eliminar la mayor cantidad posible de residuos de celda.
3. Una vez que las células se asientan, aspire el medio y las células muertas, dejando aproximadamente 10 ml de medio que contiene las células vivas.
4. Agregue ~ 20 mL de medio de bajo bFGF (DMEM/F12 suplementado con 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamina, 1x aminoácido no esencial (NEAA), 0,05% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,1 mM de monotioglicerol (MTG) suplementado con 30 ng/mL de bFGF).
5. Revisa las celdas el día 2. Si la mayoría de las células se ven sanas y brillantes, no hay necesidad de hacer nada. Sin embargo, si más de un tercio de las células parecen oscuras, reemplace el medio (utilizando la misma técnica de inclinación que en el paso 3.2) con ~ 20 mL de medio de bajo bFGF complementado con 20 ng/mL de bFGF.
6. El día 3, reemplace la mitad del medio (utilizando la técnica de inclinación en el paso 3.2) con 20 mL de medio de bajo bFGF complementado con 10 ng/mL de bFGF.
7. En el día 5, reemplace la mitad del medio (utilizando la técnica de inclinación en el paso 3.2) con 20 mL de medio de inducción neural (NIM: DMEM/F12, 1x suplemento de N2, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL de heparina)
   nota: Si hay grandes grupos de células u organoides que son mucho más grandes que los demás, deben eliminarse del cultivo. El tamaño se estima por la apariencia bajo el microscopio; Por ejemplo, el uso de un ocular con retícula. La mayoría de los organoides tienen un tamaño similar (aproximadamente 100 ± 20 μm). Eliminamos organoides que eran aproximadamente 2 veces más pequeños o más grandes que los demás.
8. Reemplace la mitad del medio (~ 15 mL) (usando la técnica de inclinación) con NIM cada dos días.
9. Después de 3 semanas en cultivo, añadir 100x penicilina/estreptomicina al medio (NIM: DMEM/F12, 1x suplemento de N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL de heparina) a una concentración final de 1x si se desea. Actualice los medios cada dos días.
   nota: De esta manera, mantuvimos los organoides hasta 6 meses en cultivo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suplemento B27	Gibco, Waltham, MA, Estados Unidos	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.	PHG0263
Bsa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	A9647
Dispasa	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá	7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, Estados Unidos	10010023
Factor de Crecimiento Reducido Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, Nueva York, Estados Unidos	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, Wisconsin, Estados Unidos	WA09
heparina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	9041-08-01
L-glutamina	Gibco, Waltham, MA, Estados Unidos	25030-081
Monotioglicerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	M6145
Medios mTESR	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, EE. UU.	400-163
NEAA	Gibco, Waltham, MA, Estados Unidos	11140-050
Tritón X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	T8787-100ML
Matraces T75 de fijación ultra baja	Corning, Corning, Nueva York, Estados Unidos	3814