1. Disección ventral del mesencéfalo y de la médula espinal
NOTA: Realice todos los pasos siguientes excepto los pasos 1.1.1-1.1.3 y 1.1.5-1.1.6 bajo un microscopio estereoscópico de disección de fluorescencia. El tiempo total de disección por experimento suele ser de 3 a 5 horas, dependiendo de la competencia en la técnica de disección y del número de neuronas motoras necesarias para cada experimento.
- Disección ventral del mesencéfalo
- Sacrificar a una rata embarazada aproximadamente 11,5 días después de la fertilización por gas de dióxido de carbono y dislocación cervical.
- Rocíe bien el abdomen con etanol y extraiga el útero con tijeras de microdisección estériles y pinzas de vendaje para el pulgar. Lave el útero brevemente con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), luego transfiéralo a la placa de disección llena de PBS estéril preenfriado.
- Extraiga cuidadosamente los embriones positivos para IslMN:GFP (neurona motora de islotes: proteína fluorescente verde) del útero utilizando tijeras de microdisección estériles, pinzas de vendaje para el pulgar y pinzas Dumont #5 en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) helada bajo la luz brillante del microscopio. Con una cuchara estéril miniperforada de Moria, transfiera cada embrión a un pocillo separado de una placa de 24 pocillos llena de medio de baja fluorescencia Hibernate-E preenfriado suplementado con 1x B27. Mantenga la placa de 24 pocillos en hielo.
- Transfiera un embrión a una placa de disección estéril y cúbrala completamente con una solución salina equilibrada de Hank (HBSS) estéril y helada.
- Asegúrese de que los pasos de disección se realicen bajo la iluminación del microscopio con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Con ayuda de pinzas, extraer la cola y la cara del embrión sin dañar el mesencéfalo (Figura 1Ba). Coloque al embrión boca abajo con las extremidades a horcajadas por debajo y la cola apuntando hacia el frente del microscopio, hacia el disector (indicado por un asterisco, Figura 1Bb).
- Con unas pinzas, abra el techo del cuarto ventrículo para generar una pequeña abertura. Utilice esta abertura para enganchar pinzas en el espacio creado entre el cuarto ventrículo y su techo. Diseccionar a lo largo de la superficie dorsal del embrión rostral a la corteza y lateral a la placa del suelo y la columna motora (Figura 1Ca,b). Abra el tejido diseccionado a libro abierto para revelar los núcleos de la neurona oculomotora (nervio craneal 3 [CN3]) y la neurona troclear (nervio craneal 4 [CN4]) positivos para GFP><.
NOTA: Un pequeño trozo de tejido del mesencéfalo ventral que contiene mesénquima, CN3 y CN4 ahora estará expuesto.
- Separe cuidadosamente el mesencéfalo ventral del embrión y extraiga el tejido meníngeo con pinzas y un bisturí de microdisección. Diseccionar los núcleos bilaterales de CN3 y CN4 positivos para GFP lejos de la placa del suelo y otros tejidos circundantes negativos para GFP utilizando pinzas y un bisturí de microdisección (Figura 1D). Maximizar el número de neuronas motoras GFP positivas en el tejido extirpado, pero evite tocarlas o dañarlas.
- Si se desea una colección de núcleos CN3 y CN4 separados, corte a lo largo de la línea media de estos dos núcleos (línea punteada amarilla en la Figura 1D). Con una pipeta P1000, recoja el tejido ventral del mesencéfalo disecado con un mínimo de HBSS y colóquelo en un tubo de microcentrífuga marcado de 1,7 ml lleno de medio de disección. Almacenar en hielo hasta la disociación.
- Continúe agrupando los mesencéfalos ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con el requisito experimental (consulte el paso 4 para conocer el número ideal de células).
NOTA: Se recomienda una colección agrupada de al menos 10 mesencéfalos ventrales que produzcan aproximadamente 1 x 104 neuronas motoras CN3/CN4 porque los tejidos están sujetos a estrés durante la disociación y clasificación.
- Disección de la médula espinal ventral
- Mantenga el embrión boca abajo con la cabeza mirando hacia el frente del microscopio, hacia el disector. Sostenga el embrión con un par de pinzas e inserte la punta del otro par de pinzas en la parte caudal sin abrir del cuarto ventrículo.
- Abrir el resto del cerebro posterior y la médula espinal dorsalmente sobre toda la extensión rostrocaudal del embrión. Apertura cortando el tejido dorsal, comenzando desde el cuarto ventrículo y avanzando hacia el canal central de la médula espinal caudal utilizando las pinzas como tijeras (Figura 1Ca,b). Tenga cuidado de evitar tocar o dañar la médula espinal ventral durante este procedimiento.
- Sostenga el embrión con un par de pinzas y pellizque el colgajo del tejido dorsal a cada lado con el otro par de pinzas (Figura 1Ea,b).
NOTA: Los tejidos dorsales extirpados contienen piel dorsal, mesénquima, ganglios de la raíz dorsal (DRG), dorsal posterior del cerebro y médula espinal. Elimine la mayor cantidad posible de estos tejidos sin dañar los núcleos de las neuronas motoras espinales (SMN), ya que son adhesivos y pueden atrapar SMN durante el filtrado o causar obstrucción durante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
- Retire la médula espinal ventral con el bisturí de microdisección para perforar directamente debajo del SMN positivo para GFP. Levante la médula espinal ventral con movimientos similares a los de una sierra en ambos lados (Figura 1Fa,b). Corte la médula espinal ventral flotante transversalmente directamente por encima de C1, donde se proyecta el primer asta anterior GFP positivo (Figura 1G). Además, corte transversalmente en el límite superior de la extremidad inferior (Figura 1G). Extirpe la porción cervical (C1)-lumbar (L2-L3) de la médula espinal ventral después de este procedimiento.
- Coloque la médula espinal ventral con el lado dorsal hacia arriba y sujétela presionando el tejido negativo para GFP entre las columnas de SMN positivas para GFP con un par de pinzas. Retire el mesénquima adherido, los DRG y la médula espinal dorsal restantes recortando ambos lados de la columna de SMN positivo para GFP con el bisturí de microdisección (Figura 1H). Tenga cuidado de maximizar las neuronas motoras GFP positivas sin dañarlas.
- Con una pipeta P1000, recoja el tejido de la médula espinal ventral disecado con un mínimo de HBSS y colóquelo en el tubo de microcentrífuga de 1,7 ml marcado con SMN lleno de medio de disección. Almacenar en hielo hasta la disociación. Continúe agrupando la médula espinal ventral de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con los requisitos experimentales><.
nota: Se recomienda recolectar al menos tres médulas espinales ventrales con un rendimiento aproximado de 2,1 x 104 SMN, ya que los tejidos están sujetos a estrés durante la disociación y la clasificación.
- Recoja las neuronas motoras faciales y las extremidades de los embriones de ratón Isl MN:GFP como controles GFP positivos y GFP negativos para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), respectivamente. Las extremidades son GFP negativas porque los axones GFP positivos de las SMN aún no se han extendido a las extremidades a esta edad embrionaria.
>2. Disociación de tejidos
NOTA: El tiempo total de disociación suele ser de 1,5 h por experimento.
- Calentar la solución de papaína e inhibidor de la albúmina-ovomucoide a 37 °C 30 min antes de la disociación.
- Gire brevemente los tejidos micro disecados a baja velocidad.
- Con una pipeta P100, extraiga con cuidado la mayor cantidad posible de Hibernate E sin aspirar tejidos.
NOTA: Asegúrese de eliminar todo el Hibernate E residual después de este paso para evitar reducir la eficacia de la disociación de la papaína en el siguiente paso.
- Agregue el volumen apropiado de solución de papaína (Tabla 1) a cada uno de los tubos de microcentrífuga de 1,7 mL que contienen las muestras de tejido microdisecado.
NOTA: Se determinó el volumen apropiado de papaína para la disociación con el fin de maximizar la disociación efectiva y minimizar el estrés en las células.
- Triture suavemente 8 veces con una pipeta P200. Realice todos los pasos de trituración con cuidado para preservar la viabilidad de las neuronas motoras.
- Incubar los tubos que contienen los tejidos durante 30 min a 37 °C, agitando con los dedos 10 veces cada 10 min. Triturar suavemente cada suspensión 8 veces con una pipeta P200 después de la incubación. Girar las celdas a 300 x g durante 5 min.
- Para garantizar la eficacia de la inhibición de ovomucoides, en el siguiente paso, utilice una pipeta P1000 para eliminar y desechar la mayor cantidad posible de sobrenadante sin aspirar los tejidos.
- Vuelva a suspender los gránulos en el volumen adecuado de solución de inhibidor de la albúmina-ovomucoide (Tabla 1) triturando suavemente 8 veces con una pipeta P200.
- Espere 2 minutos para permitir que los trozos restantes de tejido no disociado se asienten en el fondo del tubo.
- Recoja la mayor cantidad posible de sobrenadante sin aspirar tejidos no disociados con una pipeta P200. Transfiera el sobrenadante a tubos de microcentrífuga nuevos de 1,7 mL.
- Si algunos trozos de tejido permanecen sin disociar después del paso 2.10, repita los pasos 2.8-2.10 para los tejidos no disociados que permanecen en los tubos de microcentrífuga originales de 1,7 mL para maximizar el rendimiento final de las células disociadas y minimizar el estrés en las células disociadas anteriormente, contenidas en el sobrenadante del paso 2.10.
- Girar las células a 300 x g durante 5 min. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante con una pipeta P1000.
- Vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de medio de disección (Tabla 1) pipeteando 8 veces con una pipeta P1000. El volumen adecuado de suspensión final se determinó para que la densidad celular no exceda de 107 células/mL, lo que puede bloquear el flujo de la máquina de citometría de flujo, pero también para que las células no se diluyan excesivamente, lo que resulta en una velocidad de clasificación más lenta.
- Filtre las suspensiones a través de filtros de células de 70 μm para eliminar cualquier grumo grande o tejido no digerido. Transfiera las suspensiones a tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml y guárdelos en hielo hasta que sea necesario.
>3. Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
NOTA: Este protocolo se optimizó utilizando un clasificador FACS equipado con un láser violeta de 15 mw 405 nm, un láser azul de 100 mw 488 nm, un láser naranja de 75 mw 594 nm y un láser rojo de 40 mw 640 nm. Las células se clasificaron como líquido de vaina en PBS estéril en condiciones asépticas a través de una boquilla de 100 μm. Con el fin de minimizar la tensión de la celda, el caudal se ajustó a una presión de muestra de 1-3, de modo que se adquirió un máximo de 1.000-4.000 eventos por segundo. El tiempo total de FACS suele ser de 1 a 2 h por experimento.
- Configure los voltajes para la dispersión frontal y lateral para que la población de celdas se pueda visualizar correctamente. La configuración de voltajes apropiados para la clasificación de celdas es compleja y requiere un operador FACS experimentado.
- Para distinguir diferentes poblaciones de celdas, trace las celdas en función del tamaño determinado por el área de dispersión directa (FSC-A) frente a la complejidad interna determinada por el área de dispersión lateral (SSC-A). Dibuje una puerta alrededor de las células vivas como se indica en la Figura 2Aa y la Figura Ba para excluir los residuos y las células muertas. Agrupe las celdas dentro de la región cerrada como población 1 (P1).
- Para excluir grupos de celdas y dobletes, trace las celdas P1 a continuación en función del ancho de dispersión lateral (SSC-W) frente al SSC-A. Limite la población de células individuales como población 2 (P2) (Figura 2Ab y Figura Bb).
- Traza las celdas P2 en función del ancho de dispersión directa (FSC-W) frente al FSC-A y limita la población de celdas individuales como población 3 (P3) (Figura 2Ac y Figura Bc).
nota: El uso de dos puertas consecutivas en 3.3 y 3.4 excluye los grupos de células y dobletes (FSC-W alto y FSC-A alto).
- Células Gate P3 basadas en GFP frente a aloficocianina (APC). El canal APC detecta la autofluorescencia. La activación de este canal evita la captura de células autofluorescentes. Utilice celdas GFP negativas para ajustar el voltaje de los canales fluorescentes FITC/GFP. Idealmente, coloque las puertas para estas poblaciones celulares alrededor de 102. Seleccione los umbrales de puerta para la población GFP positiva 4 (P4) individualmente para cada tipo de neurona motora (Figura 2Ad y Figura Bd).
NOTA: Ajuste la puerta GFP mucho más alta para SMN que para CN3s/CN4s para obtener un cultivo puro (Figura 2Ad y Figura Bd). Una puerta de GFP más baja para los cultivos de SMN conduce a la contaminación de los cultivos por glía y neuronas no motoras. Es probable que esto se deba a que hay un bajo nivel de expresión de GFP en algunas glías y neuronas no motoras debido a un promotor permeable. El porcentaje de células GFP positivas en comparación con el total de células suele ser del 0,5 al 1,5 % para las CN3/CN4 y del 1,5 al 2,5 % para las SMN. Si la disección fue exitosa, estos números se pueden usar como punto de referencia para determinar la posición apropiada para la puerta GFP positiva (Figura 2Ae y Figura Be).
- Realice FACS de acuerdo con el protocolo del fabricante. Recoja las células P4 en tubos de microcentrífuga frescos de 1,7 mL llenos de 500 μL de medio de cultivo de neuronas motoras. Almacene en hielo hasta que se emplaque.
nota: Aunque las celdas se pueden clasificar directamente en los pocillos, esto da como resultado un número impar de celdas por pocillo. Clasifique las celdas en tubos de microcentrífuga de 1,75 ml y luego coloque manualmente para lograr una distribución de recubrimiento más uniforme.
>4. Cultivo de Neuronas Motoras Primarias Purificadas
- Suspensiones diluidas de CN3/CN4 y SMN aisladas en FACS con medio de cultivo de neuronas motoras precalentado a 37 °C a densidades de 5 x 103 y 1 x 104 células/mL, respectivamente.
nota: Un embrión E11.5 produce aproximadamente 1 x 103 CN3/CN4 y 7 x 103 SMN. Sin embargo, estos rendimientos dependen en gran medida de la pureza de los tejidos disecados, la minuciosidad de la disociación celular y el umbral adecuado de las puertas de GFP durante el FACS.
- Transfiera placas de 96 pocillos prerrecubiertas con poli D-lisina (PDL) y laminina de la incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C a la campana de flujo laminar y aspire laminina de cada pocillo. Utilice las placas y los cubreobjetos inmediatamente sin lavarlos.
- Añada 200 μL de suspensiones diluidas de CN3/CN4 y SMN en cada pocillo de placas de 96 pocillos recubiertas de PDL/laminina. Las densidades finales de celdas deben ser 1 x 103 y 2 x 103 celdas/pocillo para CN3/CN4 y SMN, respectivamente.
nota: La densidad inicial de siembra de SMNs en placas de 96 pocillos (2 x 103 células/pocillo) es el doble que la de CN3s/CN4s (1 x 103 células/pocillo) con el fin de obtener números y densidades de neuronas motoras finales similares a los 2 y 9 días in vitro (DIV) (4−6 x 102 y 2−4 x 102 celdas por pocillo, respectivamente).
- Cultivo de neuronas en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2.
- Alimente las neuronas cada 5 días eliminando la mitad del medio viejo (100 μL) y reemplazándolo con el mismo volumen de medio de cultivo de neuronas motoras frescas. Asegúrese de que los procesos neuronales se vuelvan visibles en 1 DIV y se vuelvan más gruesos y largos en 14 DIV (Figura 3). Los cuerpos celulares neuronales se agrandan y tienden a agregarse en cultivos a largo plazo, particularmente para SMN (Figura 3).
NOTA: Realice todos los cambios de medio y solución dejando la mitad del volumen original del medio para evitar que se desprendan las células cultivadas. Esto incluye los pasos de fijación e inmunocitoquímica (ICC). Si se retiran todos los medios, independientemente de la suavidad, la mayoría de las células se desprenderán y se lavarán.
