Manipulación de cultivos de células madre neuronales en una instalación de producción de células

Resumen

Fuente: Stover, A. E., et al,. Cultivo de células madre pluripotentes y neurales humanas en un sistema de cultivo celular cerrado para investigación básica y preclínica. J. Vis. Exp. (2016).

El video describe el procedimiento para mantener un entorno controlado en una estación de trabajo de cultivo celular para el crecimiento y mantenimiento de células madre neuronales. Estos procedimientos implican el establecimiento de las condiciones de la cámara, los protocolos de limpieza y la preparación de los medios, manteniendo así la máxima esterilidad y reproducibilidad y sustituyendo los métodos tradicionales.

Protocolo

1. Configuración inicial

1. Ajuste de las concentraciones de gas y temperatura
   1. Usando el software, haga clic en la pestaña "Invitado" en la esquina superior izquierda de la interfaz gráfica. Inicie sesión en el sistema con un nombre de usuario y una contraseña designados. Asegúrese de que cada usuario tenga su nombre de usuario y contraseña.
   2. Haga clic en un módulo para ajustarlo (Figura 1). En la nueva ventana que muestra los ajustes actuales, haga clic en el valor de punto de ajuste de O₂ existente debajo de "Punto de ajuste" e introduzca el nivel de concentración de O₂ requerido para este módulo. Ingrese 5% O₂ si se cultivarán o manipularán células madre pluripotentes en este módulo y 9% O₂ si se cultivarán o manipularán células madre neurales. Haga clic en la marca de verificación verde para confirmar el punto de ajuste.
      nota: Dos módulos no son ajustables por gas: la campana laminar y la cámara del microscopio. Las concentraciones de gas en la campana de flujo laminar son atmosféricas, mientras que las de la cámara de proceso mantienen pasivamente las de la cámara del microscopio.
   3. Repita este paso para el CO₂. Introduzca un punto de ajuste del 5% de_CO2 para todos los módulos, excepto para las cámaras intermedias, que solo se ajustan para O₂.
   4. Monitoree las concentraciones actuales de gas etiquetadas como "valores de proceso" para asegurarse de que alcancen los nuevos puntos de ajuste.
   5. Ajuste los puntos de ajuste de gas de todos los módulos a los valores apropiados. Coincida con los niveles de CO₂ y_O2 de las cámaras que estarán expuestas entre sí. Por ejemplo, ajuste la cámara de proceso al 5% de_O2 antes de abrir una incubadora que cultive células al 5% de_O2. Además, cambie a 5% de O₂ en cualquier cámara intermedia utilizada para agregar elementos a la cámara de proceso durante este tiempo.
   6. Ajuste la temperatura de la cámara de proceso a 37 °C utilizando la misma pantalla para los ajustes de gas. Además, la temperatura del suelo de la cámara de proceso debe ajustarse a 37 °C.
   7. Haga clic en los bancos de módulos de incubación debajo de cada incubadora. Ajuste la temperatura de los bancos a 37 °C.
2. Funcionamiento de las cámaras intermedias
   1. Reúna todos los suministros necesarios para la tarea dada (alimentación, división, tinción, etc.) al principio para evitar retrasos en el flujo de trabajo. Rocíe generosamente todos los materiales con etanol al 70% y déjelos secar en la campana laminar. No rocíe frascos o placas de células, límpielas suavemente con una esponja de gasa estéril saturada con etanol al 70%.
   2. Asegúrese de que las puertas exterior e interior de la cámara intermedia estén bien cerradas. Luego, abra la puerta exterior y coloque los artículos adentro.
   3. Cierre la puerta exterior. Seleccione el módulo tampón dentro del software y haga clic en la pestaña del factor de dilución. Introduzca uno en el cuadro de factor de registro. Haga clic en start.
      Nota: Un "factor de dilución" significa que la atmósfera del módulo tampón será evacuada y reemplazada una vez con gas limpio filtrado por HEPA.
   4. Una vez que la interfaz gráfica deje de parpadear como "factor de dilución", abra la puerta interior de la cámara de almacenamiento intermedio y lleve los materiales al interior de la cámara >
   5. Primero, retire los elementos de la cámara de proceso y asegúrese de que la cámara tampón haya sufrido un factor de dilución. A continuación, abra la puerta interior, coloque los objetos que se van a retirar en el interior y cierre la puerta interior. Luego, abra la puerta exterior y retire los artículos.
      Nota: No se debe ejecutar un factor de dilución antes de abrir la puerta exterior.

>2. Introducción y alimentación de células

1. Configuración de la incubadora
   1. Coloque 3 placas de Petri en la bandeja de agua en la base de cada incubadora. Llene estos platos con agua estéril, sin llenar directamente la sartén. Mantenga el nivel de agua en estos platos, ya que son fundamentales para mantener el punto de ajuste de humedad relativa (HR) de las incubadoras.
   2. Dentro de la interfaz gráfica, haga clic en la incubadora. Debajo del punto de ajuste, haga clic en el valor de humedad relativa (HR) existente e ingrese 85%. Haga clic en la marca de verificación verde para aceptar este valor.
2. Preparación de la instalación de producción de células para células
   1. Si aún no lo ha hecho, ajuste las cámaras tampón, la cámara de proceso y una incubadora a los puntos de ajuste de gas necesarios para el tipo de celda que se introduce.
   2. Limpie la superficie de la cámara de proceso con una gasa estéril y un desinfectante no inflamable. No utilice ningún desinfectante a base de ácido peracético; En un sistema cerrado, los vapores fuertes y persistentes son tóxicos para las células de los mamíferos. En su lugar, use productos a base de cloruro de benzalconio.
   3. Continuar desinfectando. Limpie los guantes y las superficies que se tocan con frecuencia, como las manijas de las puertas. Utilice el desinfectante a fondo pero con moderación, ya que el exceso de líquido en la cámara de proceso contribuirá a la humedad, la condensación y el posible crecimiento microbiano.
   4. Limpie la superficie de la campana de flujo laminar y la cámara tampón con etanol al 70% y deje que se seque. Coloque el matraz o la placa de células (en nuestro caso, PSC (células madre pluripotentes) o NSC (células madre neurales)) en la campana y limpie brevemente su superficie exterior con una esponja de gasa estéril saturada de etanol.
   5. Coloque el matraz o la placa en la cámara tampón y ejecute un factor de dilución (paso 1.2.3).
   6. Una vez finalizado el factor de dilución, mueva inmediatamente el matraz o la placa a la incubadora adecuada. Como las incubadoras están en la parte posterior de la cámara de proceso, extraiga un estante hacia la cámara de proceso para colocar las celdas. Evite abrir las puertas de la incubadora innecesariamente o durante períodos prolongados, ya que el aire de la cámara de proceso es muy seco en comparación con el de las incubadoras y resultará en una pérdida significativa de humedad en la incubadora.
3. Alimentación de cultivos celulares
   1. Reúna los componentes del medio, como pipetas serológicas, una pipeta electrónica, una gasa y desinfectante. Además, reúna un contenedor de desechos para el medio de cultivo celular gastado, pero no lo llene con lejía. Introduzca los materiales en la cámara de proceso a través de una cámara intermedia como se describe en la sección 1.2. Organice los materiales para permitir un espacio de trabajo óptimo. Evite colocar elementos que no se utilicen en el centro de la cámara de proceso.
   2. Deje el contenedor de medios ligeramente destapado para permitir que el medio se equilibre con los niveles de CO₂ y_O2 presentes en el sistema. Algunos fabricantes de medios PSC indican no calentar los medios a 37 ºC; Si es así, use una cámara intermedia para equilibrar el medio. Deje que el medio se equilibre durante 20 minutos.
   3. Retire el medio viejo de los pocillos utilizando una pipeta estereológica adecuada y una pipeta electrónica. En el caso de las PSC, elimine todo el medio viejo, excepto una pequeña cantidad restante, para evitar la desecación durante el proceso de alimentación. En el caso de las NSC, elimine la mitad del medio antiguo. Pipetear los residuos en el contenedor de residuos.
   4. Vuelva a colocar la pipeta usada en su envoltura original y muévala a un lado de la cámara de proceso o a una cámara intermedia designada para la eliminación de residuos. Con una pipeta serológica estéril nueva, agregue medio fresco a las placas de cultivo celular y vuelva a colocar las placas en la incubadora designada.
   5. Al final de la alimentación, rocíe una gasa con desinfectante y limpie a fondo el piso y las manijas de las puertas de la cámara de proceso. Si se cultivan varias líneas celulares en el sistema, esterilice entre la alimentación de cada línea celular. Esto ayuda a minimizar el riesgo de contaminación cruzada.
   6. Retire los desechos u otros artículos innecesarios a través de una de las cámaras de amortiguación al finalizar.

>3. División de cultivos celulares

1. Pasaje enzimático de PSCs o NSCs
   1. Reúna todos los artículos necesarios para el pase. Esto incluye medios, enzimas o tampón de disociación de células no enzimáticas (este último es solo para NSC), DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco), placas o matraces, matriz extracelular (MEC), tubos cónicos y pipetas serológicas. Introdúzcalos en el sistema mediante una cámara intermedia.
   2. Cubra los platos o matraces frescos con ECM, como se describió anteriormente 9,10. Algunos ECM, como los derivados de líneas celulares de sarcoma de ratón, solo son líquidos entre 4 y 15 °C, por lo que debe usar un bloque frío esterilizado o una bolsa de hielo en gel para mantener el ECM frío mientras trabaja en la cámara de proceso calentada.
   3. Pipetear el medio gastado del cultivo y desecharlo en el contenedor de residuos.
   4. Enjuague el pocillo o la superficie del matraz con 1 ml de DPBS/pocillo y deseche el DPBS.
   5. Agregue 1 - 2 ml de enzima tibia a cada pocillo. Solo los cultivos muy densos requieren 2 ml.
   6. Mueva inmediatamente la placa de cultivo o el matraz a la cámara del microscopio y observe el cultivo. Esté atento a los signos de que las células individuales comienzan a desprenderse del plato. No espere hasta que las células floten en suspensión antes de continuar con el siguiente paso.
   7. Regrese las celdas a la cámara de proceso principal. Con una pipeta serológica de 5 ml, agregue 4 ml de DPBS por cada 1 ml de enzima y luego pipetee con fuerza hacia arriba y hacia abajo para desalojar las células de la superficie del pocillo. Si pasa por varios pocillos dentro de una placa de pared múltiple, agregue el DPBS a cada pozo antes de desalojar las celdas de los pocillos individuales.
   8. Transfiera la enzima y la suspensión celular de PBS a un tubo cónico de tamaño adecuado.
   9. Si no hay una centrífuga disponible en la instalación de producción de celdas, selle herméticamente el tubo cónico, colóquelo en una cámara intermedia y selle la puerta cerrada.
   10. Retire el tubo cónico de la cámara tampón desde el lado del flujo laminar y haga girar las células a 100 x g durante 5 min en RT.
   11. Rocíe el tubo cónico con etanol al 70% y llévelo a la cámara de proceso utilizando una cámara tampón y un factor de dilución.
   12. Pipetear el sobrenadante y volver a suspender las células en 2 ml de medio PSC o NSC. Si se pasan las PSC, incluya el inhibidor de la proteína quinasa ROCK (proteína quinasa asociada a Rho) en el medio a una concentración de 10 μM.
   13. Cuente las células con un hemocitómetro y determine los pocillos o placas necesarios. Placa PSC a 5 x 10⁴ - 1 x 10⁵ celdas/cm². Divida los NSC en una proporción de 1:2.
       Nota: Las NSC a menudo se agrupan y se resisten al conteo preciso en un hemocitómetro.
   14. Si se requiere la criopreservación de las células, asegúrese de que todos los suministros y medios de congelación estén preparados y colocados dentro de la cámara de proceso. El DMSO (Dimetilsulfóxido) es muy tóxico para las células a 37 ºC, por lo que actúa rápidamente. Mantenga el recipiente de congelación con camisa de isopropanol en RT en la campana de flujo laminar. Una vez que los viales de criopreservación estén llenos y sellados, retírelos inmediatamente de la cámara de proceso pasándolos a través de una cámara intermedia.
2. Pase manual de PSC
   1. Confirme que es necesario pasar la referencia cultural, como se ha descrito anteriormente. Si es así, prepare platos o frascos frescos recubiertos con matriz extracelular. Luego, cambia el medio por completo.
   2. Limpie la cámara del microscopio con una gasa estéril humedecida con una cantidad moderada de desinfectante no inflamable, ya que si es demasiado, se empañará en exceso. Limpie únicamente los guantes, el área del piso y el escenario. Introduzca en la cámara varias puntas de pipeta de 200 μl o 1.000 μl envueltas individualmente.
   3. Lleve la placa de PSC a la cámara del microscopio, retire la tapa y colóquela boca abajo sobre el piso recién limpiado. Dejar la tapa levantada expone la parte inferior directamente a las corrientes de aire y a la posible contaminación.
   4. Desenvuelva la punta de una pipeta y, utilizando el microscopio para visualizar el cultivo, separe las colonias con buena morfología utilizando la punta de la pipeta.
      Nota: La punta de la pipeta se puede acoplar a una pipeta si al usuario individual le resulta más cómodo.
   5. Vuelva a colocar la tapa de la placa y vuelva a colocar la placa en la cámara de proceso.
   6. Pipetee el exceso de ECM de la nueva placa y transfiera los medios de la placa antigua (que contiene las piezas de colonia en suspensión) a la nueva placa. Si el plato viejo todavía contiene colonias que no están listas para ser recogidas, aliméntalas también.

Resultados

Figura 1. Interfaz gráfica para la planta de producción de células. (A) La representación gráfica del CPF es la pantalla predeterminada y coincide con el dibujo CAD que se muestra en la Figura 3. Al hacer clic con el ratón sobre el módulo de búfer 1, se abre la pantalla de control (B), donde los valores de O₂ se establecen para que coincidan con la cámara ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema Xvivo	Biospherix	Hecho a medida
Software Xvivo	Biospherix	Versión I.O.2.1.2.1
Colector de O2	Amico	P-M2H-C3-S-U-OXY
Colector de CO2	Amico	M2H-C3-D-U-CO2
Colector N2	Innovador del Oeste	CTM75-7-2-2-BM
Gas O2
Gas CO2
Gas N2
placa de Petri
Agua
Gasa estéril
70% etanol	BDH	BDH1164-4LP
Desinfectante a base de cloruro de benzalconio
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
Búfer de disociación celular basado en Hank	Tecnologías de la Vida	13150-016
Pipeta serológica de 2 ml	VWR	89130-894
Pipeta serológica de 5 ml	Plásticos Olympus	12-102
Pipeta serológica de 10 ml	Plásticos Olympus	12-104
Pipeta serológica de 25 ml	Plásticos Olympus	De 12 a 106
Pipeta serológica de 50 ml	Plásticos Olympus	12-107
Placa de 6 pocillos	Corning	353046
Puntas de pipeta de 20 uL	Eppendorf	22491130
Puntas de pipeta de 200 uL	Eppendorf	22491148
1000 puntas de pipeta	Eppendorf	22491156
Microscopio con cámara DP21 y fluorescencia	Corporación Olympus	CKX41
Sodio tamponado con fosfato	Hyclone	9236
Dimetilsulfóxido	Protide	PP1130
Guantes

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