Purificación de células precursoras endoteliales CD31+ mediante clasificación de células activadas magnéticamente

Resumen

Fuente: Matsuo, K., et al. Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas a células similares a células endoteliales microvasculares cerebrales con un fenotipo inmune maduro. J. Vis. Exp. (2023).

Este video muestra una técnica para purificar células progenitoras endoteliales CD31⁺ (EPCs) de un cultivo utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). La suspensión celular se trata con un anticuerpo conjugado con fluoróforos que se une a CD31 en las EPC. Completar el etiquetado de las EPC CD31⁺ implica agregar un complejo de anticuerpos, que se une a los fluoróforos, y una nanopartícula magnética recubierta de polímero, que se une al complejo de anticuerpos. A continuación, las células marcadas se purifican mediante un campo magnético, descartando las células CD31^-.

Protocolo

La línea de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), HPS1006, fue proporcionada por el RIKEN BRC a través del Proyecto Nacional de Recursos Biológicos del MEXT/AMED, Japón.

>1. Inducción de la diferenciación de hiPSC en células progenitoras endoteliales (EPCs)

1. Placas y reactivos recubiertos de matriz extracelular (ECM)
   1. Prepare placas de 12 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal alícuota 2,5 mg de gel de matriz en tubos de centrífuga de 50 ml para su almacenamiento a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Añada en el tubo 30 ml de la mezcla fría de medio y nutrientes F-12 (DMEM/F12) de Eagle modificada de Dulbecco, que se ha conservado en un frigorífico (4 °C). Mezcle suavemente pipeteando hasta que el gel se haya descongelado y luego agregue 500 μL de la solución a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. Coloque la placa en una incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante al menos 1 h.
      nota: El gel de matriz de membrana basal es sensible a la temperatura y debe manipularse de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la alícuota y el recubrimiento de placas. La concentración de proteínas de la matriz extracelular puede variar entre lotes. Para garantizar la precisión, la concentración exacta debe mencionarse en la hoja de certificado de calidad para el lote específico, utilizando el número de lote. Por ejemplo, si la concentración exacta es de 10,0 mg/mL, utilice 250 μL de gel para un total de 2,5 mg.
   2. Prepare la solución madre del inhibidor de la rho-cinasa (ROCK) disolviendo el inhibidor de ROCK en agua estéril a una concentración de 10 mM (Tabla 1). Alicuone la solución madre en volúmenes de 100-200 μL y almacene a -20 °C para evitar ciclos de congelación y descongelación.
   3. Prepare una solución madre de 100 mg/mL de ácido L-ascórbico disolviendo 5 g de ácido L-ascórbico en 50 mL de agua estéril y almacene a -20 °C (Tabla 1). Agregue 6,25 mL de glutamina y 305 μL de solución madre de ácido L-ascórbico en 500 mL de DMEM/F12 avanzado para hacer un medio LaSR (Tabla 1). Almacenar a 2-8 °C durante un máximo de 2 semanas.
   4. Prepare CHIR99021 solución disolviendo CHIR99021 en dimetilsulfóxido (DMSO) sin diluir hasta una concentración final de 10 mM (Tabla 1). Alicuente la solución en volúmenes de 100-200 μL para evitar ciclos de congelación y descongelación y almacene a -20 °C durante un máximo de 1 año. Almacene las alícuotas de trabajo de la solución madre a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   5. Prepare el medio DMEM/F12-10 añadiendo 50 mL de suero fetal bovino inactivado por calor a 450 mL de DMEM/F12. Almacene el medio a 2-8 °C hasta por 1 mes (Tabla 1).
   6. Prepare el tampón de flujo-1 añadiendo 33,3 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 7,5% a 467 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco (Tabla 1). Almacenar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.
2. Siembra de hiPSCs singularizadas y expansión para la diferenciación de EPC (Día -3 a Día -1)
   1. Comienza la diferenciación cuando las colonias de hiPSC en una placa de 6 pocillos no muestran diferenciación espontánea y tienen la densidad adecuada para el paso, generalmente alrededor del 80% de confluencia (2.5-3.5 x 10⁶ celdas). Monitoree cuidadosamente las células espontáneamente diferenciadas bajo el microscopio para asegurarse de que se requieren múltiples pasajes para eliminar las células no diferenciadas. Consulte la nota proporcionada a continuación, paso 1.4.15, para obtener información sobre el medio de cultivo celular y la matriz extracelular.
   2. Aspirar el medio y añadir 1 mL de reactivo de disociación a los pocillos e incubar durante 5-7 min a 37 °C. Disociar y singularizar las células pipeteando suavemente la solución de reactivo de disociación sobre las superficies de los pocillos dos o tres veces.
   3. Transfiera las células separadas a un tubo de 15 mL que contenga 4 mL de medio de mantenimiento hiPSC y vuelva a suspender las células completamente. Reserve una alícuota de 10 μL para el recuento de células.
   4. Granular las células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C. Cuente las células y calcule el volumen necesario para lograr una densidad adecuada de hiPSCs (75-400 x 10³ por pocillo) en una placa de 12 pocillos recubierta de matriz de membrana basal (paso 1.1.1).
   5. Aspire la solución de recubrimiento de los pocillos y agregue 1 mL de medio hiPSC que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK en cada pocillo (dilución 1:1,000). Después de centrifugar, aspire el sobrenadante y disocie el pellet en 1 mL de medio hiPSC.
   6. Agregue el volumen requerido de hiPSC, determinado en el paso 1.2.4, a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. De dos a cuatro placas de 12 pocillos pueden ser suficientes para diferenciar un clon de hiPSC. Consulte el paso 1.2.4 para determinar el número de placas necesarias para sembrar celdas.
   7. Coloque la placa en una incubadora (37 °C, 5% CO²). Distribuya uniformemente las células deslizando suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y luego de lado a lado en la incubadora.
   8. Al día siguiente (es decir, día -2), cambie el medio con 2 mL de medio de mantenimiento hiPSC que no tenga inhibidor de ROCK. Al día siguiente (Día -1), cambie el medio por 2 mL de medio de mantenimiento hiPSC fresco.
3. Inducción de EPCs con el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3) CHIR99021 (Día 0 a Día 5)
   1. En el día 0, reemplace el medio de mantenimiento hiPSC en cada pocillo con 2 mL de medio LaSR que contenga 8 μM CHIR99021.
   2. El día 1, aspire el medio y agregue 2 mL de medio LaSR fresco que contenga 8 μM CHIR99021.
   3. En los días 2, 3 y 4, reemplace el medio con 2 ml de medio LaSR fresco que le falte CHIR99021.
4. Clasificación por células activadas magnéticamente (MACS) para purificar CD31+ EPCs (Día 5)
   1. El día 5, aspire el medio y luego agregue 1 mL de reactivo de disociación a cada pocillo, antes de incubar durante 6-8 min a 37 °C.
   2. Disociar y singularizar las células con una micropipeta y pasarlas a través de un filtro de células de 40 μm para filtrar la suspensión en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de medio DMEM/F12-10. Filtre la suspensión celular recolectada de más de dos placas de 12 pocillos en al menos dos tubos de 50 mL.
   3. Detenga la reacción de digestión agregando medio DMEM/F12-10 (hasta 50 mL). Pipetear a fondo y reservar 10 μL para el recuento de células. Granular las células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
   4. Después de retirar el sobrenadante, añada 10 mL de medio DMEM/F12-10 y transfiera la suspensión celular a tubos nuevos de 15 mL. Granular las células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
   5. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en el tampón de flujo-1 a una densidad de 1,0 x 10⁷ células por cada 100 μL de tampón.
   6. Añada el reactivo de bloqueo del receptor Fc (FcR) en una proporción de 1:100 e incube durante 5 minutos antes de añadir el anticuerpo CD31 marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluido 1:200. Incubar la suspensión durante 30 minutos en la oscuridad a 20-25 °C.
   7. Añadir 10 mL de tampón de flujo-1, reservando 10 μL de la suspensión para el análisis de citometría de flujo para determinar la fracción de células CD31⁺ (Figura 1).
   8. Granular las células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 20-25 °C. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender hasta una densidad de 1,0 x 10⁷ células por 100 μL de solución tampón de flujo-1. Añadir el cóctel de selección FITC (5 μL por cada 100 μL de suspensión celular). Mezclar bien pipeteando e incubar en la oscuridad durante 15 minutos a 20-25 °C.
   9. Añadir 5 μL de nanopartículas magnéticas por cada 100 μL de suspensión celular, pipetear bien e incubar en la oscuridad durante 10 min a 20-25 °C.
   10. Transfiera la suspensión celular a un tubo de citometría de flujo de 5 mL y agregue tampón de flujo-1 para lograr un volumen total de 2,5 mL. Coloque el tubo de citometría de flujo en el imán durante 5 min.
   11. En un movimiento continuo, invierta el imán y decante la suspensión celular que contiene células que no fueron marcadas con el anticuerpo FITC-CD31. Mantenga el imán y el tubo en posición invertida durante 2-3 segundos y, a continuación, retire el líquido restante. Aspire las gotas en el borde del tubo antes de volver a colocar el tubo en posición vertical.
   12. Tome el tubo de citometría de flujo del imán y agregue 2,5 mL de tampón de flujo-1 para lavar las células CD31⁺ restantes. Vuelva a suspender las células pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Coloque el tubo de flujo en el imán durante 5 minutos.
   13. Repita los pasos 1.4.11-1.4.12 tres veces y luego el paso 1.4.11 una vez más para un total de cuatro lavados.
   14. Retire el tubo de flujo del imán y añada la cantidad indicada de un medio adecuado (por ejemplo, medio libre de suero endotelial humano [hECSR] para cultivo de CE prolongado o medio de congelación para congelación) al tubo para resuspender las células CD31⁺ purificadas. Reserve dos alícuotas de 10 μL de la suspensión, una para el recuento de células y la segunda para realizar el análisis de citometría de flujo para evaluar la pureza de las células CD31⁺ en muestras post-MACS (Figura 1). Si no se dispone de un citómetro de flujo inmediatamente, almacene la alícuota a 4 °C hasta el análisis.
   15. Congele los EPC CD31+ en este punto.
       nota: Las placas de 12 pocillos recubiertas de vitronectina y el medio de mantenimiento hiPSC más estable (mTeSR plus) se pueden utilizar en lugar de las placas recubiertas de matriz de membrana basal y el medio de mantenimiento hiPSC (mTeSR1). Para preparar placas de 12 pocillos recubiertas de vitronectina, diluya la vitronectina con tampón de dilución hasta una concentración final de 10 μg/mL y luego transfiera 500 μL de la solución diluida a cada pocillo de las placas de 12 pocillos. Deje las placas a 20-25 °C durante al menos 1 h. La densidad de siembra de las hiPSCs singularizadas es comparable a la utilizada para las placas recubiertas de matriz de membrana basal. El cambio del medio de cultivo o de la composición de la matriz puede afectar a la proliferación y diferenciación espontánea de las hiPSC, que suelen requerir de 1 a 2 semanas para adaptarse a las nuevas condiciones de cultivo. Si se utiliza el medio de mantenimiento hiPSC más estable para el mantenimiento de hiPSC, este medio se puede utilizar para la diferenciación EPC en lugar del medio de mantenimiento hiPSC. En este caso, el medio de mantenimiento hiPSC más estable debe cambiarse en el día -2 para eliminar el inhibidor de ROCK, y se puede omitir el intercambio en el día -1.

Resultados

Tabla 1: Detalles de los reactivos específicos para los ensayos. Se describe el nombre y la cantidad exacta de ingredientes para cada reactivo específico.

Reactivo específico	ingrediente	volumen
Ácido acético, solución de 0,5 mg/mL	ácido acético

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de jeringa de 0,22 mm	TPP	99722
Tubo de centrífuga de 15 mL	halcón	352196
Filtro de células Falcon de 40 μm	halcón	352340
5 mL Tubo de fondo redondo	Spl	40005
Tubo de centrífuga de 50 mL	halcón	352070
Placa de 96 pocillos, fondo redondo	Spl	34096
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-500ml
ácido acético	Sigma-Aldrich	695092
DMEM/F12 avanzado	Tecnologías de la Vida	Año 12634
Microscopio de fluorescencia todo en uno	Clave	BZ-X810
Suplemento B-27 (503), sin suero	Thermo Fischer Scientific	17504044
Albúmina sérica bovina (BSA), 7,5% en dPBS	Sigma-Aldrich	A8412
Tampón de dilución CellAdhere	Tecnologías STEMCELL	ST-07183
CHIR99021	Productos químicos de Selleck	S1263
Colágeno IV de placenta humana	Sigma-Aldrich	C5533
Placas de cultivo de tejidos Corning (12 pocillos)	Corning	3512
Placas de cultivo de tejidos Corning (6 pocillos)	Corning	3506
Tapa interior de tubo criogénico 2.0 mL	Watson	1396-201S
Dimetilsulfóxido (DMSO), estéril	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM (13), [+] 4,5 g/L D-glucosa, [-] L-glutamina, [-] piruvato	Thermo Fischer Scientific	31053-028
Dulbecco (d) PBS (sin calcio, magnesio)	Termo Fisher	14190250
Mezcla de medio/nutriente Eagle modificada de Dulbecco F-12 (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
EasySepFITC Kit de Selección Positiva II	Tecnologías STEMCELL	Año 18558
EasySepMagnet	Tecnologías de células madre	Año 18000
Solución de ácido etilendiaminotetraacético0.02% en DPBS	sigma	E8008-100ML
Suero fetal bovino, calificado	Thermo Fischer Scientific	10270106
Solución tampón HEPES	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Medio libre de suero endotelial humano (hESFM)	Thermo Fischer Scientific	11111-044
Factor de crecimiento 2 de fibroblastos humanos (FGF2)	Tocris	233-FB-500
Células madre pluripotentes inducidas humanas iPS	Riken RBC	HPS1006
Sulfato de kanamicina (100x)	Thermo Fischer Scientific	15160-047
Ácido L-ascórbico, 2-fosfato, sesquimagnesio, sal, hidrato	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-Glutamina 200 mM (1003)	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Matrigel, factor de crecimiento reducido	Corning	354230
MEM NEAA (1003)	Thermo Fischer Scientific	11140-035
Inhibidor de ROCK Y-27632	Tocris	Año 1254
Base RPMI medium 1640 Tris	Sigma-Aldrich	93362
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	X100