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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación del medio madre y recuperación de células madre
- Prepare el stock de medio de cultivo (DFHGPS) combinando los reactivos en los pasos 1.1.1.-1.1.5.
- Añadir 210 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium con alto contenido de glucosa y L-glutamina (D). Guárdelo a 4 °C.
- Agregue 70 ml de la mezcla de nutrientes F12 de Ham con el suplemento de L-glutamina (F). Guárdelo a 4 °C.
- Añade 4,2 mL de 15 mM de tampón HEPES (H) y guárdalo a temperatura ambiente.
- Añadir 4,2 mL de solución de D-glucosa al 10% (G) y almacenar a temperatura ambiente.
- Añadir 2,88 mL de solución de penicilina/estreptomicina (PS). Alicuente la solución madre en alícuotas de 3 mL y almacene las alícuotas a -20 °C hasta que las necesite.
nota: La concentración final de penicilina en el medio será de 100 unidades/mL, y la concentración de estreptomicina será de 100 μg/mL. Este medio se denominará DFHGPS durante el resto del protocolo y debe almacenarse a 4 °C para su uso en un plazo de 1 a 2 semanas. Si es necesario, el DFHGPS puede ampliarse proporcionalmente.
- El día antes de la recuperación de las células, rebochar un matraz T75 con 5 mL de medio acondicionado obtenido de cultivos previos de la línea celular hNSC y dejarlo en una incubadora a 37 °C con 8,5% de dióxido de carbono (CO2) durante la noche.
nota: Si actualmente está cultivando hNSCs, guarde el medio en el que las células han estado creciendo durante un cambio de medio. Este es un medio condicionado ya que ha sido "condicionado" por las células. El medio acondicionado puede guardarse en un tubo con tapón de rosca y almacenarse a 4 °C durante aproximadamente 7 días. Póngase en contacto con el autor correspondiente para recibir las hNSC. Se prefiere el medio condicionado, pero no es absolutamente necesario, especialmente cuando se inicia el cultivo de hNSCs.
- El día de la recuperación, caliente 20 ml de DFHGPS en un tubo con tapón de rosca de 50 ml en un baño de agua a 37 °C durante al menos 10 minutos y manténgalo en el baño de agua hasta que esté listo para usar.
- En un tubo de rosca separado de 15 ml, caliente 10 ml de DFHGPS en un baño de agua a 37 °C durante al menos 10 minutos y manténgalo en el baño de agua hasta que esté listo para usar en el paso 1.13.
- Recupere un recipiente con hielo y todos los componentes del medio (Tabla 1). Descongele todos los componentes medios en el hielo y déjelos en el hielo mientras se prepara para el cambio de medio.
- Obtenga 5 mL de medio acondicionado (almacenado a 4 °C) y manténgalo en un baño de agua a 37 °C hasta que esté listo para usar en el paso 1.14. Consulte la nota después del paso 1.2 si no hay un medio condicionado o un cultivo actual de células madre neurales fetales humanas.
- Recupere el tubo de rosca de 50 ml del paso 1.3 y colóquelo en la cabina de bioseguridad (BSC). Transfiera 10 mL de DFHGPS a un nuevo tubo con tapón de rosca de 15 mL y luego vuelva a colocar el tubo de 50 mL que contiene los 10 mL restantes de medio DFHGPS en el baño de agua a 37 °C.
- Obtener un crio-vial de hNSCs almacenadas en nitrógeno líquido. Consulte la nota después del paso 1.2 si no existe actualmente un cultivo de células madre neurales fetales humanas.
nota: Las células madre neurales humanas se derivaron originalmente de cerebros fetales humanos desechados12 y se mantuvieron en cultivo sin modificaciones genéticas10. 5 × 106 celdas deben descongelarse y colocarse en un matraz T75. Cada criovial debe contener 5 × 106 células; Por lo tanto, se necesita un vial por matraz.
- Descongele un vial de células en un baño de agua a 37 °C invirtiendo el vial cada 10 s durante aproximadamente 1 minuto o hasta que el hielo se derrita y el contenido del vial esté completamente líquido. No sumerja todo el vial bajo agua para evitar una posible contaminación.
- En el BSC, utilice una micropipeta P1000 para aspirar la solución celular descongelada y añádala gota a gota al tubo de 15 ml del paso 1.7, que contiene 10 ml de DFHGPS. Para agregar la solución celular descongelada gota a gota, presione lentamente el émbolo para que solo se liberen una o dos gotas a la vez. Mientras tanto, agite el tubo de 15 ml para permitir una mezcla rápida.
- Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante, asegurándose de retener la pelletización de la célula.
- Durante el paso 1.11, recupere el tubo de 50 ml que contiene los 10 ml restantes del paso 1.7. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet de la célula en el DFHGPS de 10 mL y vuelva a centrifugar a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Durante el centrifugado final, prepare el nuevo medio de crecimiento siguiendo la Tabla 1 para agregar factores de crecimiento a los 10 mL de medio DFHGPS del paso 1.4 (Tabla 1) en BSC. Deje el nuevo medio que contiene factores de crecimiento en el BSC hasta que esté listo para usar.
- Recupere el matraz T75 del paso 1.2 y deseche el medio acondicionado que recubre el matraz por aspiración. A continuación, añada los 5 ml de medios acondicionados del paso 1.6. al matraz con una pipeta serológica. Tenga cuidado de no rayar el fondo del matraz.
- Recupere el tubo de células de la centrífuga y deseche el sobrenadante aspirándolo, dejando intacto el pellet de celdas.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de medio nuevo a partir del paso 1.13 utilizando una pipeta serológica de 5 mL y pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Añada la suspensión al matraz T75 recubierto del paso 1.14. Use los 5 mL restantes para enjuagar el tubo que contenía el pellet de celda y luego agregue esos 5 mL al matraz también.
- Agite el matraz T75 hacia adelante y hacia atrás 3 veces para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente por el matraz. Asegúrese de que la tapa del matraz esté suelta para permitir el flujo de aire. Bajo un microscopio óptico, observe las células, tome notas y tome imágenes si es posible.
nota: Las células deben tener un aspecto translúcido y esférico. Tome nota si hay celdas que se ven oscuras, opacas o tienen bordes asimétricos, ya que esto puede indicar la muerte celular. Además, esté atento a cualquier contaminación fúngica o bacteriana, como que el medio se vuelva de color amarillo.
- Coloque el matraz de células en una incubadora a 37 °C con 8,5% de CO2,
nota: Utilice 8,5% en lugar de 5,0% de CO2 para mantener el pH de este medio de cultivo sin suero en el rango de 7,1-7,4.
2. hNSC Cambio de medio
>NOTA: Cambie el medio cada 3-4 días.
- Encienda el BSC y limpie a fondo con etanol al 70%. Observe las células bajo un microscopio óptico.
nota: Tome notas sobre la apariencia de las celdas y los tamaños de las esferas. Tres días después de la recuperación o el paso, las células se agruparán y comenzarán a formar neuroesferas no adherentes.
cautela: Si las células se adhieren al fondo del matraz, el cultivo deberá descartarse, ya que la adherencia celular aumentará la diferenciación prematura y las células no podrán mantener un estado madre. Si hay demasiadas células en el matraz, las células pueden formar esferas grandes (de más de 2 mm de diámetro), en cuyo caso, las células del centro de la esfera comenzarán a diferenciarse debido a la falta de acceso a los factores de crecimiento del medio. Si se observan esferas de más de 1 mm de diámetro, se pueden pasar las celdas (pasos 3.1-3.22).
- Siga los pasos 1.4 y 1.5 y prepare 10 ml de medio fresco (consulte el paso 1.13).
- Incline el matraz hacia un lado, permitiendo que las esferas se hundan hasta el fondo del matraz.
- Retire 5 mL de medio acondicionado de la parte superior del medio agrupado con una pipeta serológica de 5 mL, teniendo cuidado de no aspirar ninguna neurosfera. Coloque los 5 mL de medio acondicionado en un tubo limpio de 15 mL.
- Retire 5 mL adicionales de medio acondicionado del matraz, evitando nuevamente cuidadosamente las esferas, y coloque los 5 mL en el mismo tubo de 15 mL.
- Añada 10 mL de medio nuevo del paso 2.2 a los 5 mL restantes de medio acondicionado y células en el matraz. Coloque el matraz plano y observe las células bajo un microscopio óptico.
- Si parece que se han aspirado células durante la recolección del medio acondicionado, centrifugue el medio acondicionado a 100 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células que se acumulen en el fondo en 1 mL del medio acondicionado y luego agréguelas al matraz de cultivo.
- Guarde los 10 ml de medios acondicionados no utilizados de los pasos 2,5/2,6 a 4 °C en un tubo con tapón de rosca de 15 ml.
- Repita los pasos 1.17/1.18.
>3. Pasaje hNSC
- Si expande los NSC a un nuevo matraz, asegúrese de que todos los matraces nuevos estén recubiertos como en el paso 1.2.
- Limpie el BSC como en el paso 2.1 y realice los pasos 1.4 y 1.5.
- Prepare el medio como en el paso 1.13. Cada matraz T75 requiere 10 mL de medio. Para varios matraces T75, multiplique 10 mL de medio por el número de matraces.
- Prepare 1 o 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (dPBS) y glucosa de Dulbecco y colóquelo en un baño de agua a 37 °C para calentar durante 10 min (para la solución de tripsina) de acuerdo con los volúmenes de la Tabla 2. No agregue tripsina ni DNasa en este momento. La DNasa puede ser necesaria para descomponer cualquier ADN liberado de las células muertas debido a la disociación mecánica o química >6 celdas si 5 × 106 se sembraron originalmente en el matraz. Por lo general, se usa 1 mL de solución de dPBS para 10 × 106 celdas. Por lo tanto, se necesitan 3 mL de solución de dPBS para un matraz T75 pasado después de 9-10 días.
- Coloque un bote de pesaje pequeño limpio y un hemocitómetro en el capó. Limpiar con etanol al 70% y dejar secar al aire en la campana durante aproximadamente 5 min.
nota: El bote de pesaje se utilizará en los pasos 3.17.1.
- Recupere el matraz de células que se sacarán de la incubadora y se llevarán al BSC. Incline el matraz suavemente permitiendo que las células se hundan hasta el fondo del medio agrupado. Hay aproximadamente 15 mL de medio en el matraz.
- Retire aproximadamente 10 ml de medio en porciones de 5 ml (es decir, 5 ml + 5 ml). Coloque estos 10 mL de medio en un tubo limpio de 15 mL etiquetado como "CM" para "medio acondicionado". Tenga cuidado de no aspirar ninguna de las células depositadas en los 5 ml restantes de medio en el matraz; estas células y 5 mL de medio se someterán al paso 3.8.
- Tome 3 mL de medio acondicionado del tubo "CM" (del paso 3.7) y colóquelo en un tubo de 15 mL etiquetado como "solución inhibidora de tripsina". Esto se utilizará en el paso 3.12. Después de retirar los 3 mL, quedan 7 mL de medios acondicionados en el tubo "CM". Deje el tubo "CM" a un lado hasta el paso 3.9.
- Retire los 5 ml de medios y células que quedan en el matraz T75 y colóquelos en un tubo limpio de 15 ml etiquetado como "Cells".
- Tome el tubo "CM" que contiene 7 mL de medio acondicionado (del paso 3.7.1) y enjuague el fondo del matraz T75 dos veces con porciones de 3,5 mL de medio acondicionado utilizando una pipeta serológica de 5 mL. Después de cada enjuague, coloque las porciones de 3,5 ml en el tubo "Cells". El propósito de este paso es eliminar todas las neuroesferas (células) del matraz T75.
- Centrifugar el tubo "Cells" a 100 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Mientras las células están girando, obtenga una solución de dPBS/glucosa de un baño de agua a 37 °C y agregue la cantidad adecuada de tripsina y DNasa de acuerdo con la Tabla 2.
- Después de que el tubo "Cells" haya dejado de girar, retire todo el sobrenadante del medio acondicionado y transfiéralo al tubo "CM".
- Tome el tubo etiquetado como "solución inhibidora de tripsina" del paso 3.7.1 y agregue el volumen de inhibidor de tripsina indicado en la tabla 3. Utilice el mismo volumen de solución de inhibidor de tripsina que se utilizó para la solución de tripsina.
- Coloque la solución inhibidora de tripsina en el baño de agua a 37 °C hasta que la necesite.
- Agregue la solución de tripsina al gránulo de celda en el tubo de 15 mL y pipetee hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 5-10 veces con una pipeta de 5 mL. Cierre el tapón del tubo e incube en un baño de agua a 37 °C durante 5 min. Después de 5 minutos, recupere las células y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces. A continuación, incubar en el baño de agua a 37 °C durante 10-15 minutos más.
- En los últimos 5 minutos, mueva la solución del inhibidor de tripsina al BSC.
- Recupere las células una vez completado el paso 2.14 y pipetee las células hacia arriba y hacia abajo hasta que las esferas estén completamente disociadas (20-30 veces). A continuación, añada inmediatamente la solución de inhibidor de tripsina y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Esta solución de células disociadas e inhibidor de tripsina se denominará "suspensión celular".
- Cuente el número de celdas en la suspensión celular siguiendo los pasos.
- Pipetee 15 μL de premezcla de Trypan Blue (que contiene 5 μL de 0,4% de Trypan Blue y 10 μL de dPBS) en un pequeño bote de pesaje y luego agregue 5 μL de la suspensión celular. Pipetea hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para mezclar. A continuación, pipetee 10 μL de la suspensión de azul de tripán/célula a cada lado de un hemocitómetro cubierto con un cubreobjetos de vidrio.
- Observe las células bajo un microscopio óptico y cuente el número total de células en cada una de las cuatro cuadrículas de las esquinas. Suma estos números.
- Repita la cuenta para el otro lado y promedie los dos lados juntos.
- Multiplique este número por 10,000 para obtener el número total de células por ml. Multiplique este número por el número total de mililitros para calcular el número total de células en la suspensión celular. Calcule cuánto volumen de suspensión celular se necesitará para sembrar 5 millones de células por matraz T75.
nota: Por lo general, después de 9-10 días, un T75 tendrá 25-30 × 106 celdas. Por lo tanto, si se pasan todas las células a nuevos frascos, se necesita un total de 5-6 frascos.
- Añada el volumen de suspensión celular calculado en el paso 3.19 a cada matraz T75 para obtener 5 × 106 células por matraz. Si el volumen es inferior a 5 mL, agregue un medio de condición adicional para hacer un total de 5 mL. A continuación, añada 10 mL de nuevo medio DFHGFPS que contenga factores de crecimiento (Tabla 1) al matraz.
- Repita los pasos 1.17 y 1.18 y asegúrese de que el matraz esté etiquetado con el tipo de celdas, las fechas, el número de celdas en el matraz y el número de paso (este es el número de veces que se ha pasado la celda). A continuación, vaya al paso 4.
- Si es necesario, siembre células adicionales en un matraz T75 con una densidad de hasta 30 × 106 células por matraz durante la noche y congele al día siguiente de acuerdo con el Paso 4.
>4. Congelación y almacenamiento de hNSC
- Al día siguiente de la pasada, saque el matraz de la incubadora que contiene las células para congelar (de los pasos 3.19 y 3.22). Incline el matraz y retire todo el medio y las células del matraz, y colóquelo en un tubo de 15 mL. A continuación, centrifuga el tubo a 216 x g durante 5 min.
- Durante el proceso de centrifugación, prepare el medio de congelación (Tabla 4). Por cada 5 × 106 células, prepare 1 ml de medio de congelación. El número de celdas se determinó en el paso 3.19 al determinar cuántas celdas poner en cada matraz. Este número no habrá cambiado de la noche a la mañana.
- Prepare viales de crioconservación con etiquetas con el nombre de la célula, el número de paso, el número de célula, las iniciales y la fecha. Después de la centrifugación, elimine el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet de células en medio de congelación para que haya 5 × 106 células/mL. Con una pipeta de 5 mL, alícuota 1 mL por vial y sellar herméticamente (5 × 106 células por vial).
- Coloque los viales en un recipiente de crioconservación con 250 mL de isopropanol (el uso máximo es de 5 veces por reemplazo de isopropanol). Almacene en un congelador a -80 °C durante la noche y luego transfiéralo a un sistema de almacenamiento de nitrógeno líquido.
>5. Enchapado adherente hNSC para validación
- El día antes del paso (pasos 3.1-3.22), limpie el BSC como en el paso 2.2 y obtenga una placa de 24 pocillos y cubreobjetos de vidrio estéril de 12 mm.
- Con unas pinzas, coloque un solo cubreobjetos en el fondo de cada pocillo de la placa.
- Cubrir los pocillos que contienen cubreobjetos con 0,01% de poli-D-lisina (PDL) en agua estéril e incubar durante 1 h a 37 °C. Para una placa de 24 pocillos, use 250 μL de PDL por pocillo.
- Retire el PDL de los pocillos y luego cúbralo con 1 μg/cm2 de laminina/dPBS (250 μL por pocillo). Incubar la placa durante la noche a 37 °C. Si no lo necesita al día siguiente, selle la placa con parafilm envolviendo el parafilm alrededor de los bordes de la placa y guárdelo a 4 °C.
nota: Las placas recubiertas con laminina se pueden almacenar hasta 2 semanas si se sellan con parafilm, siempre y cuando los cubreobjetos no se sequen.
- Pase las celdas como se describe en los pasos 3.1-3.22 y, a continuación, determine el número de células que se van a sembrar en la placa de 24 pocillos con cubreobjetos recubiertos.
- Retire el exceso de solución de laminina de los pocillos mediante aspiración y enjuague una vez con 0,5 ml de dPBS. A continuación, siembre las células en los pocillos a una densidad de 0,6-1 x 105 células/cm2 por pocillo. Utilice las celdas restantes de acuerdo con los pasos 3.16 a 3.21.
- En varios momentos durante el cultivo de placa de 24 pocillos, fije y tiña las células para obtener varios marcadores de células madre.