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1. Generación de agregados iPSC
- Generación de cultivos monocapa unicelulares a partir de colonias de iPSC
- Prepare una placa de 6 pocillos recubierta de extracto de membrana basal (BME). Descongele el BME en el hielo a 4 °C durante 2-3 h, dilúyalo con el medio Eagle Modificado F12 frío de Dulbecco (DMEM-F12; dilución 1:50), cubra la placa con 1 mL/pocillo de la solución de BME diluida y almacene la placa durante la noche a 4 °C.
- Aspire el medio y lave las colonias intactas de iPSC de al menos dos pocillos de una placa de 6 pocillos con 0,5 mM de EDTA en solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces antes de incubar las colonias con 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en PBS durante 4 min a temperatura ambiente (RT). Aspire la solución de EDTA y separe suavemente las colonias lavándolas del fondo del plato con 5 mL de medio DMEM-F12. Recoja en un tubo de 15 ml y granule por centrifugación (4 min a 1.200 x g a RT).
NOTA: Las iPSC reprogramadas a partir de fibroblastos disponibles en el mercado se han utilizado con éxito.
- Aspirar el sobrenadante e incubar las colonias de iPSC con 500 μL de reactivo de disociación celular durante 6 min a 37 °C.
- Pipetee la suspensión celular varias veces suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL para romper los grupos de células restantes en células individuales.
- Añada 4 mL de DMEM-F12 a la suspensión celular para diluir el reactivo de disociación celular.
- Gire las celdas hacia abajo a 1,200 x g durante 4 minutos en RT.
- Vuelva a suspender las células en 2 mL de medio iPSC suplementado con 5 μM Y-27632 y células semilla en un pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta de BME.
nota: Utilice el medio iPSC especificado en la Tabla de materiales para cultivos de iPSC monocapa de una sola célula.
- Al día siguiente, reemplace el medio con un medio iPSC nuevo que carezca de Y-27632. A partir de este punto, continúe cultivando las células, cambiando el medio todos los días hasta que las iPSC sean 100% confluentes. Dependiendo de la línea celular y de la confluencia de los pozos de inicio, esto tardará entre 2 y 4 días.
- Una vez confluentes, pase por las iPSCs. Aspirar el medio y aplicar 500 μL de reactivo de disociación celular sobre las células.
- Incubar las células durante 5-10 min a 37 °C. Mecer suavemente la placa para separar las células.
- Lave las células del pocillo con 2 mL de DMEM-F12 y recójalas en un tubo de 15 mL. Agregue DMEM-F12 para un volumen total de 5 mL.
- Centrifugar las células a 1.200 x g durante 4 min en RT y aspirar el sobrenadante.
- Siembre las células en medio iPSC suplementado con 5 μM de Y-27632 en una proporción de 1:2 a 1:4 en una placa de 6 pocillos recubierta de BME (2 mL/pocillo de medio).
- Continúe cultivando las células durante 2-5 días y cambie el medio iPSC que falta Y-27632 todos los días. Una vez confluentes, paso iPSCs (pasos 1.1.4-1.1.8).
nota: Cultive las iPSC durante al menos 2 pasos como monocapa en el medio de iPSC especificado en la Tabla de materiales antes de utilizarlas para la generación de agregados de iPSC para permitir que las células se adapten a las condiciones de cultivo.
- Utilice cultivos de iPSC monocapa cuando sean 70-90% confluentes para la generación de agregados de iPSC.
NOTA: la iPSC se adaptó a las condiciones de cultivo, ya que las células individuales son menos propensas al estrés que conduce a la muerte celular durante el procedimiento de disociación y agregación. Los cultivos monocapa de iPSC deben mostrar una morfología pluripotente típica sin evidencia de diferenciación. Analice los cultivos de forma regular para detectar la contaminación por micoplasma. Trabaje solo con cultivos iPSC libres de micoplasma.
- Aspire el medio de cultivo de un pocillo de una placa de 6 pocillos y aplique 500 μL de reactivo de disociación celular sobre las células.
- Incubar las células durante 5-10 min a 37 °C. Mecer suavemente la placa para separar las células.
- Lave las células del pocillo con 2 mL de DMEM-F12 y recójalas en un tubo de 15 mL. Agregue DMEM-F12 para un volumen total de 10 mL.
- Para el recuento de células, tome 25 μL de la suspensión celular y mézclelo con 25 μL de azul de tripán para marcar las células muertas. Cuente las células vivas usando una cámara de conteo.
- Recoja suficientes células (4.500 células por agregado de iPSC) de la suspensión celular en un tubo de 15 ml.
- Centrifugar las células a 1.200 x g durante 4 min en RT y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en un volumen adecuado de medio iPSC suplementado con 50 μM Y-27632 para obtener 4.500 células vivas por 150 μL.
nota: El uso de una alta concentración de Y-27632 (50 μM) es fundamental para la supervivencia de las iPSC.
- Coloque 150 μL en cada pocillo de una placa inferior en U de 96 pocillos de baja fijación y colóquela en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2,
nota: Al generar agregados de iPSC, tenga en cuenta que se necesitan al menos 6 organoides para el control de calidad en el día 20 (ver Sección 5).
>2. Inducción del neuroectodermo anterior
- Monitoree de cerca los cambios en la morfología de los agregados de iPSC todos los días bajo el microscopio de cultivo de tejidos utilizando una lente de potencia 4X o 10X. Observe en el día 1, agregados de células con bordes claros. Continúe cultivando agregados de iPSC en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
nota: Un cierto número de células muertas/pocillo es normal y no afectará la generación de organoides.
- Alimente los agregados de iPSC a partir del día 2 y continúe cada dos días aspirando suavemente aproximadamente 2/3 del medio sin alterar los agregados celulares en la parte inferior. Agregue 100 μL adicionales de medio iPSC sin Y-27632.
nota: Dentro de 4-6 días, los agregados celulares tendrán 350-450 μm de diámetro y exhibirán bordes lisos.
- En esta etapa, agrupe los agregados celulares con una punta de pipeta cortada de 100 μL en una placa de 6 cm de fijación baja (máximo de 20 agregados/placa) en un medio de inducción cortical que contenga DMEM-F12 con suplemento de N2 (1:200), suplemento de B27 (1:100), glucosa (0,2 mg/mL), monofosfato de adenosina cíclico (AMPc; 0,15 μg/mL), 0,5% de aminoácidos no esenciales (NEAA), L-alanil-L-glutamina al 1%, heparina (10 μg/mL) y los compuestos LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) e inhibidor de la respuesta Wnt-1 (IWR-1) (10 μg/mL). Alimente los agregados celulares cambiando el medio de inducción cortical 3 días después de transferirlos a la placa de 6 cm.
- Monitoree de cerca los cambios morfológicos durante la inducción cortical bajo el microscopio de cultivo de tejidos utilizando una lente de potencia 4X.
nota: Después de 4-5 días en medio de inducción cortical, los bordes de los agregados celulares deben comenzar a aclararse en la superficie, lo que indica diferenciación neuroectodérmica. En esta etapa, emerge la organización radial de un epitelio pseudoestratificado. Continúe con la Sección 3 para incrustar los agregados de celdas en una matriz BME.
>3. Incrustación de agregados neuroectodérmicos en un andamio de matriz
- Descongelar BME en hielo a 4 °C durante 2-3 h. Alícuota de BME sin diluir en cantidades suficientes.
- Prepare una lámina de película de parafina de plástico para el procedimiento de incrustación. Corte la película de parafina plástica con unas tijeras estériles en trozos grandes de 4 cm x 4 cm, coloque un trozo de la película de parafina plástica sobre una bandeja de puntas vacía de 100 μL para puntas de 100 μL y presione con un dedo enguantado para crear pequeños hoyuelos en la lámina de película de parafina plástica (se necesita 1 hoyuelo/agregado de celda). Limpie la película de parafina plástica con etanol al 70% e irradie con luz ultravioleta (potencia: 15 vatios, longitud de onda: 435 nm) bajo el banco estéril cerrado durante 30 minutos.
- Transfiera cada agregado de celda a un hoyuelo de la lámina de película de parafina plástica con una punta de corte de 100 μL con una abertura de 1,5-2 mm de diámetro. En el caso de que dos agregados de células estén fusionados, no los separe, sino transfiéralos juntos a un hoyuelo.
- Aspire suavemente el medio que rodea los agregados celulares con una punta de pipeta de 100 μL sin cortar.
nota: Tenga cuidado de no succionar los agregados de celdas en la punta, ya que esto dañará los agregados.
- Añadir 40 μL de BME sin diluir a cada agregado de célula.
- Coloque cada agregado de celda en el centro de la gota de BME con una punta de pipeta de 100 μL sin cortar.
nota: Tenga mucho cuidado de no dañar el neuroepitelio en desarrollo con la punta de la pipeta.
- Transfiera con cuidado la lámina de película de parafina de plástico con pinzas estériles a una placa de Petri de 10 cm (u otra placa de cultivo celular suficiente) y coloque la placa en la incubadora durante 15-20 minutos para permitir que el BME se solidifique.
- Mientras tanto, prepare un plato de 6 cm de baja fijación que contenga 5 mL de medio de inducción cortical.
- Después de la polimerización de BME, elimine las gotas que contienen los agregados celulares de la lámina de película plástica de parafina. Con pinzas estériles, dé la vuelta a la película de parafina plástica y exprima suavemente los agregados celulares en el plato de 6 cm de fijación baja ligeramente inclinado (aproximadamente 30 °) hasta que las gotas caigan de la hoja de película de parafina plástica. Transfiera un máximo de 16 agregados de celdas a un plato de 6 cm.
- Continúe incubando los agregados celulares a 37 °C.
>4. Generación de organoides de tipo prosencéfalo a partir de agregados neuroectodérmicos
- Un día después de la inclusión en una matriz BME, coloque las placas de cultivo de organoides en un agitador de cultivo celular oscilante con un ángulo de inclinación de 5 ° y 14 rpm, instalado en una incubadora de cultivo celular.
- Controle los organoides todos los días. Las estructuras neuroepiteliales homogéneas en forma de bucle se desarrollan gradualmente después de incrustarse en la matriz BME.
- Cuando las estructuras del bucle neuroepitelial sean visibles, cambie el medio a un medio de diferenciación de organoides que contenga DMEM-F12 con suplemento de N2 (1:200), suplemento de B27 (1:100), glucosa (0,2 mg/mL), AMPc (0,15 μg/mL), 0,5% NEAA, 1% L-alanil-L-glutamina, insulina (2,5 μg/mL)
- Reemplace el medio de diferenciación del organoide cada 3-4 días hasta que se alcance el punto de tiempo de diferenciación deseado. A continuación, fije los organoides (consulte la sección 5).
nota: Ocasionalmente, el tejido puede exhibir yemas de tejido ópticamente translúcido sin estructuras de bucle. Aunque esto no es lo ideal, no está afectando el desarrollo de las estructuras corticales. Los organoides se pueden cultivar en un medio de diferenciación de organoides durante un máximo de 40 días. Para periodos de cultivo prolongados (40-100 días) el medio de diferenciación de organoides puede complementarse con BME 1:50 para aumentar la complejidad de los tejidos y con BDNF y GDNF para permitir la supervivencia y maduración neuronal.