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1. Preparación de los materiales necesarios para el cultivo de iPSC y la diferenciación de BEC.
- Recubrimiento de matriz de plástico de cultivo de tejidos (TC) para cultivo IMR90-4 iPSC
- Gel de matriz de membrana basal alícuota (por ejemplo, Matrigel) en alícuotas de 2,5 mg y almacenar a -20 °C.
nota: Trabaje rápidamente al manipular el gel de matriz y la alícuota en hielo, ya que forma un gel por encima de 4 °C y no se puede alícuota una vez que se ha solidificado.
- Para recubrir el plástico TC, agregue rápidamente una alícuota de gel de matriz a 30 mL de medio Eagle Modified Eagle (DMEM)/F12 de Dulbecco en un tubo cónico de 50 mL. Agregue 1 mL del medio sobre el gel de matriz congelada, pipetee hacia arriba y hacia abajo hasta que se descongele y transfiéralo inmediatamente al tubo cónico de 50 mL con el medio restante.
- Utilice 1 mL de esta solución de recubrimiento de gel de matriz por pocillo de una placa de 6 pocillos y 12 mL por matraz T75.
nota: El plástico TC recubierto de gel Matrix se puede preparar hasta dos semanas antes de su uso. Sin embargo, es fundamental evitar que la solución de gel de matriz se seque, lo que puede requerir la adición ocasional de más DMEM/F12 en la parte superior de los pocillos.
- Prepare el medio de mantenimiento de células madre agregando 50 mL de suplemento 50x a 450 mL de medio basal de mantenimiento de células madre en el ambiente estéril de un gabinete de bioseguridad.
- Para preparar 500 mL de medio incondicionado (UM), combine 392,5 mL de DMEM/F12 con 100 mL de reemplazo de suero knock out (KOSR), 5 mL de aminoácidos no esenciales, L-glutamina a una concentración final de 1 mM y 3,5 μL de β-mercaptoetanol. Filtrar-esterilizar y almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Para preparar 200 mL de medio de células endoteliales (EC) más ácido retinoico (AR) más bFGF, combine 198 mL de medio libre de suero endotelial humano (hESFM), 2 mL de suero derivado pobre en plaquetas (PDS) esterilizado por filtro y 20 ng/mL de bFGF. Filtrar, esterilizar y almacenar hasta 2 semanas a 4 °C. Justo antes de la adición a las células, agregue 10 μM de RA al medio EC.
nota: Dado que el PDS se ha interrumpido y, por lo tanto, puede ser limitado, este protocolo se ha llevado a cabo con éxito utilizando B27 en lugar de PDS.
- Para preparar 200 mL de medio EC sin AR o bFGF, combine 198 mL de hESFM y 2 mL de PDS esterilizado por filtro y esterilizante por filtro. Almacenar hasta 4 semanas a 4 °C.
>2. Diferenciación de células endoteliales cerebrales de iPSCs humanas
- Recubrimiento de iPSCs para diferenciación (día -3 del protocolo de diferenciación)
- El cultivo de mantenimiento según IMR90-4 se utiliza bien para colocar placas para la diferenciación, aspirar el medio de cultivo, agregar 1 mL de reactivo de disociación de células enzimáticas por pocillo e incubar a 37 °C durante 7 min.
- Inactive el reactivo de disociación de células enzimáticas transfiriendo 1 mL de suspensión celular disociada a un tubo cónico de 15 mL con al menos 2 mL de medio de mantenimiento de células madre frescas por 1 mL de células. Gire la suspensión de la celda a 1.500 x g durante 5 min.
- Vuelva a suspender el pellet de células en 1 mL de medio de mantenimiento de células madre por pocillo de células IMR90-4 utilizadas, y cuente las células con un hemocitómetro.
nota: Puede ser útil diluir 1:1 con 0,4% de azul de tripán para distinguir entre células vivas y muertas al contar. Dependiendo de la densidad de las iPSC, un pocillo de una placa de 6 pocillos suele producir 1-10 x10 6 células.
- Para la diferenciación en un matraz T75, añadir 7,5 x 105 células a 12 mL de medio de mantenimiento de células madre e inhibidor de ROCK (diclorhidrato Y27632) a una concentración final de 10 μM. Aspirar la solución de recubrimiento de gel de matriz de un matraz T75 y transferir la suspensión celular al matraz. Distribuya las celdas uniformemente agitando el matraz de un lado a otro y de izquierda a derecha e incube a 37 °C y 5% de CO2.
nota: Es fundamental agregar un inhibidor de ROCK en este paso para mejorar la supervivencia de las células madre individuales disociadas. Las células deben distribuirse uniformemente a través del matraz y en singletes que exhiban una morfología dispersa, similar a la mesénquima, debido al tratamiento con inhibidores de ROCK.
- En el día -2 y el día -1, cambie el medio a un medio de mantenimiento de células madre frescas; 12 mL por T75.
- En el día 0, comience la diferenciación cambiando el medio a UM; 12 mL por T75.
- Cambiar UM diariamente (día 1 – día 5).
nota: Las células generalmente alcanzan la confluencia después de 2 a 3 días en UM, lo que se puede observar a simple vista o a través de un microscopio de campo claro invertido. A medida que avanza la diferenciación, los "tractos neuronales" de nestina+ se vuelven visibles con células PECAM-1+ en medio.
- Expandir selectivamente la población de células endoteliales cambiando a un medio EC con 20 ng/mL de bFGF y 10 μM de ácido retinoico (AR) (día 6) e incubando durante dos días. El medio EC con bFGF se puede preparar hasta dos semanas antes. El RA se añade a partir de las existencias congeladas el día de su uso (por ejemplo, 1 μL de 10 mM de existencias de RA por 1 mL de EC + bFGF).
nota: También se puede lograr una diferenciación exitosa sin la suplementación de AR en los días 6 y 8. Sin embargo, la omisión de AR producirá BEC con TEER reducido.
- Cubra las placas de cultivo celular y los insertos de membrana (por ejemplo, Transwell) con colágeno IV y fibronectina (día 7), para la purificación de los BEC y los experimentos posteriores.
- Para el recubrimiento de los insertos de membrana, combine 4 partes de colágeno IV (1 mg/mL en ácido acético de 0,5 mg/mL), 1 parte de fibronectina (1 mg/mL) y 5 partes de agua estéril de grado tisular. La solución de ECM se puede diluir 1:5 para recubrir las placas de cultivo celular (es decir, 4 partes de colágeno IV, 1 parte de fibronectina, 45 partes de agua). Incubar con solución de recubrimiento a 37 °C durante la noche.
NOTA: Las placas y los insertos de membrana también se pueden recubrir durante al menos 4 h antes del subcultivo el mismo día de la etapa de purificación.
- Purifique las BEC mediante el subcultivo de las células diferenciadas en placas o membranas recubiertas de colágeno IV y fibronectina (día 8).
- Aspirar el medio EC y añadir el reactivo de disociación de células enzimáticas (12 mL por T75). Incubar a 37 °C hasta que el 90% de las células se hayan desprendido del matraz.
nota: La disociación celular puede tardar hasta 1 h.
- Durante el tiempo de incubación, retire la solución de recubrimiento de colágeno IV/fibronectina de las placas/insertos previamente preparados y déjelos secar en una campana estéril. Los insertos tardan aproximadamente 20 minutos en secarse.
- Una vez que las células se hayan desprendido, lávelas del matraz con una pipeta de 10 ml. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para lograr una suspensión de una sola célula.
nota: La suspensión de una sola célula es importante para un recuento fiable de células y para lograr monocapas sólidas.
- Diluir con al menos el mismo volumen de hESFM fresco en un tubo cónico de 50 mL y contar las células con un hemocitómetro.
- Granular las células a 1.500 x g durante 10 min.
- Vuelva a suspender las células en el volumen adecuado de EC + bFGF + RA recién preparado para lograr una suspensión de 2 x 106 células/mL para la siembra en insertos de membrana. Agregue 500 μL (1 x 106 celdas) en la parte superior de un inserto de 12 pocillos y 1,5 mL de medio EC + bFGF + RA en la parte inferior. Para la siembra en placas de 24 y 48 pocillos, diluya la suspensión celular 1:2 y agregue 500 μL (5 x 105 celdas) y 250 μL (2.5 x 105 celdas) por pocillo, respectivamente. Distribuya las células uniformemente por el pocillo/inserto e incube a 37 °C con un 5% deCO2.
- Cambie los medios en placas/transpocillos a EC sin bFGF o RA (día 9).