Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF)
Recoja el tejido adiposo del arco periaórtico (PAAT) de 5-6 ratones en un tubo de microcentrífuga de 2 mL que contenga 1 mL de medio digestivo recién preparado y pique el tejido con tijeras quirúrgicas en un tubo Eppendorf a temperatura ambiente (RT).
- Transfiera la mezcla a tubos de 50 mL que contengan 9 mL del medio de digestión. Homogeneizar los tejidos pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL 10x.
- Incubar los tubos a 37 °C con agitación constante a 100 rpm durante 30-45 min y comprobar cada 5-10 min para evitar la sobredigestión. Esto es fundamental para mejorar la viabilidad y el rendimiento de las células.
nota: Una buena digestión de los tejidos dará como resultado un tejido adiposo homogéneo de color amarillo claro que es visible a simple vista al girar suavemente el tubo.
- Detenga la digestión añadiendo 5 mL de HDMEM que contenga 10% de FBS y 1% v/v PS en RT y mezcle bien mediante pipeteo.
- Centrifugar la suspensión de la célula a 500 x g durante 5 min en RT. El SVF será visible como una bolita de color marrón. Aspirar cuidadosamente los adipocitos flotantes y decantar el sobrenadante restante sin alterar la FSV. Disuelva el pellet de SVF en 10 mL de medio de cultivo y filtre a través de un filtro de células de 70 μm.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el pellet en 5 mL de tampón de lisis globular en un tubo cónico de 15 mL durante 10 min a RT.
- Detenga la reacción agregando 10 mL de 1x PBS que contenga 1% de FBS. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 10 mL de 1x PBS que contenga 1% de FBS.
- Centrifugar las células de nuevo a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 5 mL de medio de cultivo en un tubo cónico de 15 mL a 4 °C.
- Después de una ronda final de centrifugación (500 x g durante 5 min a 4 °C), vuelva a suspender las células peletizadas en 5 mL de tampón FACS (PBS que contiene 10% de FBS, 100 unidades/mL DE DNA I y 1% v/v PS) en hielo, y cuente las células con un hemocitómetro.
>2. Aislamiento de NCADSCs por FACS
- Configure y optimice el clasificador de células siguiendo el manual de instrucciones. Seleccione la boquilla de 100 μm, esterilice los tubos de recolección, instale el dispositivo de recolección requerido y configure los chorros laterales.
- Para clasificar las celdas RFP+, se recomienda un láser amarillo/verde de 561 nm y un filtro óptico 579/16. Realice la compensación utilizando el control negativo y los controles positivos de una sola mancha. Consulte la Figura 1A para ver el esquema de compuertas.
- Filtrar las células a través de un colador de 40 μm, centrifugar a 500 x g durante 5 min y volver a suspenderlas en 2 mL de tampón FACS a una densidad de 0,5–1 x 107/mL. Transfiera las celdas a tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml claramente etiquetados y cárguelos en el clasificador.
- Ejecute el tubo de muestra experimental a 4 °C, encienda las placas de deflexión y clasifíquelo en un tubo cónico de 15 mL prerrecubierto con RPMI que contiene 1% de FBS y 1% v/v PS.
nota: Proteja las muestras de la luz intensa para minimizar el enfriamiento de RFP.
>3. Cultura de las NCADSCs
- Colocar las células clasificadas a una densidad de 5.000 células/cm2 en una placa de cultivo de 12 pocillos en un medio de cultivo completo e incubar a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 durante 20-24 h.
- Retire el medio de cultivo, lave las células con PBS precalentado (37 °C) para eliminar los restos celulares y agregue un medio de cultivo fresco.
