Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Preparación de soluciones estériles de poli-D-lisina (PDL) y laminina
- Al menos un día antes del aislamiento celular, prepare placas recubiertas de poli-D-lisina (PDL) y laminina.
nota: Se prepararon placas de 6 y 12 pocillos en función de los objetivos experimentales. Por lo general, se utilizaron placas de 12 pocillos para el análisis cuantitativo mediante Western blots, mientras que las placas de 6 pocillos se utilizaron para contener cubreobjetos esterilizados en autoclave (estériles) para la inmunohistoquímica. Se utilizaron placas de 24 pocillos para cultivar células gliales entéricas (EGC) para la obtención de imágenes de flujo de Ca2+.
- Soluciones madre diluidas con agua ultrapura de grado de cultivo de tejidos, sin DNasa y sin RNasa en una campana de cultivo de tejidos con aire filtrado por HEPA.
- Cubreobjetos de vidrio esterilizantes
- Sostenga el cubreobjetos con pinzas estériles y sumérjalos en un vaso de precipitados de 100% etanol durante 15 min. Deje que el etanol se evapore en la campana de cultivo de tejidos y luego colóquelo en las placas de 6 pocillos.
- Alternativamente, coloque varios cubreobjetos individualmente en papel secante de 2 mm de grosor en un recipiente de plástico y luego en autoclave.
>2. Placas de recubrimiento
NOTA: Realice estos pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos estériles.
- Descongele 1 mg/mL de caldo de PDL y diluya 1:10 con agua estéril apta para cultivo de tejidos hasta que la concentración final sea de 100 μg/mL. Use 2 mL por pocillo para cubrir placas de 6 pocillos, 1 mL para cubrir un pocillo de una placa de 12 pocillos y 0,5 mL para un pocillo en las placas de 24 pocillos. Almacene el PDL diluido restante en alícuotas de 12 mL a -20 °C.
- Después de dejar que la PDL cubra los pocillos durante al menos 1 h, retire la PDL con una pipeta estéril. Deje que las placas se sequen completamente al aire bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos.
nota: Después de retirar la solución de PDL con una pipeta estéril, se puede utilizar dos veces más en 1 semana después de pasar por un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
- Descongele el caldo de laminina en hielo para evitar la formación de gel.
nota: La laminina sin diluir se solidifica cuando se calienta por encima de 8 °C.
- Diluir el stock de laminina (0,5 mg/mL) 1:50 con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) estéril de Dulbecco para obtener una concentración final de 10 μg/mL. Almacene la laminina diluida en alícuotas de 12 ml a -20 °C.
- Agregue laminina diluida a los pocillos que contengan PDL seco. Use 1 mL para cubrir la superficie de 6 pocillos y 0.5 mL para cubrir la parte inferior de las placas de 12 pocillos. En el caso de los cubreobjetos, añada 400 μL de laminina diluida a los cubreobjetos para lograr la cobertura de la superficie.
- Incubar las placas recubiertas a 37 °C durante 2 h, si la placa se utiliza el mismo día (recubrimiento rápido). De lo contrario, selle las placas con una envoltura de plástico y guárdelas durante la noche a 4 °C (recubrimiento lento).
nota: El sellado es fundamental para evitar el secado y la contaminación.
- Retire la solución de laminina con cuidado con una pipeta para evitar rayar la superficie. Lave suavemente los pocillos tres veces con DPBS estéril.
- Agregue medios de crecimiento glial completos a cada pocillo y mantenga las placas a 37 °C hasta que esté listo para agregar la suspensión de EGC
nota: Las placas recubiertas de lisina poli-D y laminina se pueden almacenar durante 3 días a 4 °C. Cubra las placas con varios días de anticipación y luego guárdelas a 4 °C; lavar las placas con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) estéril de Dulbecco tres veces. Agregue 2 ml de DPBS estéril a cada pocillo después del lavado final. Selle la placa con parafilm y guárdela a 4 °C. Es fundamental asegurarse de que la laminina no se seque.
>3. Preparación de soluciones de aislamiento
- Prepare la solución de disociación EDTA/HEPES/DPBS. Para 500 mL de la solución, use DPBS estéril (sin calcio ni magnesio) para hacer una solución final de 10 mM de HEPES y 5 mM de EDTA. A 490 mL de DPBS, agregue 5 mL de tampón HEPES 1 M y 5 mL de solución madre de EDTA 0.5 M. Conservar a 4 °C hasta su uso.
- Prepare los medios de resuspensión de células gliales utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 1.
- Prepare los medios de crecimiento glial utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 2.
nota: Los medios de crecimiento glial que contienen GDNF pueden almacenarse durante una semana a 4 °C.
>4. Extirpación del segmento intestinal
NOTA: A los ratones se les permitió el libre acceso a alimentos y agua antes de la eutanasia mediante el método de gotas de isoflurano y la extracción de un órgano vital. Se utilizaron ratones C57BL/6 mayores de 8 semanas de edad. Se utilizaron ambos sexos sin diferencias notables en la preparación.
- Aplicar la eutanasia al ratón con una sobredosis de isoflurano y colocarlo en decúbito supino en una bandeja de disección. Sujetar las extremidades con alfileres y esterilizar el abdomen con etanol al 70%. Cubra la piel con pinzas y luego abra el abdomen con unas tijeras.
- Levanta el hígado e identifica el estómago/píloro distal. A continuación, extraiga 7 cm del intestino proximal. Tenga cuidado de no desgarrar el intestino.
- Sostenga el píloro con pinzas mientras corta el mesenterio.
- Use una disección roma con la parte posterior de la tijera para raspar el páncreas adherido.
- Coloque el segmento intestinal en DPBS helado sin Ca2+ o Mg2+ (Figura 1A).
nota: Otros segmentos del intestino o del colon también se pueden extirpar con la misma técnica.
- Utilice una jeringa de 5 o 10 ml conectada a una aguja de 20 g de extremo romo para enjuagar el contenido fecal con DPBS helado (Figura 1B).
- Divida el intestino en segmentos de 3 cm para eliminar el músculo longitudinal. NOTA: Se utilizan segmentos intestinales de hasta dos ratones por cada 30 ml de la solución de aislamiento HEPES/EDTA/DPBS.
- Rompe unos 4 cm para separar el palo de madera de la punta de algodón. Remoje el palo de madera en DPBS (Figura 1C).
- Deslice suavemente uno de los segmentos intestinales sobre el palito mojado (Figura 2A-C).
- Retire el mesenterio adherido que aún está unido con pinzas de punta de aguja (Figura 2D).
- Use una hoja de afeitar limpia o un bisturí para hacer dos cortes longitudinales a lo largo del intestino donde se unió el mesenterio (Figura 2E).
- Humedece la punta de algodón con DPBS. Frote la punta de algodón mojada longitudinalmente a lo largo del músculo para aflojar el músculo longitudinal/plexo mientérico (LMMP). Luego, mueva la punta de algodón horizontalmente para separar el LMMP del músculo circular a lo largo del segmento intestinal durante la extracción del LMMP.
- Sostenga la punta del palo entre el pulgar y el índice mientras estabiliza el segmento con el dedo medio y el cuarto dedo (Figura 2F). Cuando esté completo, el LMMP se despegará fácilmente del segmento intestinal.
- Deseche el LMMP extraído del tubo intestinal y adherido al hisopo de algodón a menos que se desee recolectar EGC del plexo mientérico.
- Use una hoja de afeitar para abrir el segmento intestinal longitudinalmente para quitarlo del palo de madera.
- Almacene el tejido intestinal despojado (predominantemente mucosa y submucosa más músculo circular) en DPBS en hielo. Repita los pasos 4.4 a 4.11 hasta que todos los segmentos intestinales estén preparados.
5. Extirpación de la mucosa epitelial
- Corta los intestinos en trozos más pequeños de ~0,5 cm con unas tijeras finas.
- Coloque el tejido en un tubo centrífugo cónico estéril de 50 mL que contenga 30 mL de solución helada de EDTA/HEPES/DPBS.
- Agite la solución que contiene tejido a 4 °C durante 10 minutos a ~60 inclinaciones por minuto.
- Humedecer previamente una pipeta de plástico de 5 ml pipeteando el tampón EDTA/HEPES/DPBS hacia arriba y hacia abajo una vez, y luego usar la pipeta prehumedecida para pipetear el tejido y la suspensión tampón hacia arriba y hacia abajo (trituración) 20 veces para desalojar la mucosa epitelial.
- Recoja el tejido de la incubación de EDTA vertiendo la mezcla a través de un colador de células de nailon de 100 μm. Deseche el flujo turbio lleno de mucosa (Figura 3).
- Coloque el tejido retenido en el colador en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 50 mL que contenga 30 mL de EDTA/HEPES/DPBS helado utilizando pinzas de punta de aguja.
- Repita la incubación de EDTA/HEPES/DPBS por segunda vez meciendo el tejido a 4 °C durante 10 minutos a ~60 inclinaciones por minuto para eliminar la mucosa epitelial adicional.
- Humedezca previamente una pipeta de 5 ml con el tampón y luego pipetee la suspensión de tejido hacia arriba y hacia abajo 20 veces para desalojar las células mucosas.
nota: El tejido tenderá a adherirse al interior de la pipeta a medida que se elimine más epitelio.
- Recoja el tejido después de la segunda incubación vertiendo la mezcla a través de un colador de células de nailon de 100 μm y deseche el flujo. El segundo flujo debe ser notablemente menos turbio que el primero (Figura 3).
- Repita las incubaciones de EDTA de 10 minutos hasta que la solución esté casi clara (alrededor de 3 a 4 incubaciones dependiendo de la cantidad de tejido y la efectividad de la trituración) (Figura 3).
>6. Colección de células gliales entéricas de la lámina propia y la submucosa
- Transfiera el tejido del colador de nailon a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL que contenga 5 mL de la solución de recuperación celular disponible comercialmente y cocine durante 25-30 min a 4 °C.
- Triturar suavemente 10 veces para disociar las células gliales entéricas de la lámina propia.
- Filtre a través de un filtro de 40 μm y recoja el filtrado en un tubo limpio de 50 mL.
- Enjuague el pañuelo en el filtro de nailon con 1 mL de DPBS.
- Deseche el pañuelo y transfiera los ~5-6 mL de filtrado a un tubo de centrífuga cónico limpio de 15 mL.
- Centrifugar el filtrado a 2.000 x g en una centrífuga de cubo oscilante durante 5 min a 4 °C.
- Vuelva a suspender el pellet que contiene células gliales en al menos 1 mL de tampón de resuspensión pipeteando suavemente el pellet hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 500 μL. Evite introducir burbujas.
nota: Ajuste el volumen de resuspensión según sea necesario para el número de pocillos y placas. Por ejemplo, 1,2 mL para una placa de 6 pocillos, 2,4 mL para dos placas de 6 pocillos, 2,4 mL para una placa de 12 pocillos.
- Pipetear 200 μL de la suspensión celular en cada pocillo de los 6 pocillos o 100 μL para placas recubiertas de laminina PDL de 12 pocillos que contengan medios de crecimiento glial.
- No moleste las placas después de agregar las celdas a las placas y colocarlas en la incubadora a 37 °C para permitir que se adhiera el máximo número de celdas.
nota: Una preparación saludable de células se adherirá en un plazo de 6 a 8 horas, pero espere al menos 24 horas antes de cambiar el medio pipeteando suavemente el medio junto con las células no adherentes.
- Utilice las células para experimentos 3-4 días después de que se coloquen en cultivo (Figura 4).
Tabla 1. Composición de los medios de resuspensión de células gliales.
| Componentes | Volumen a añadir | Concentración final |
| DMEM/F12 | 44.5 mL | _ |
| Suero fetal bovino (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicilina-Estreptomicina | 500 μL | Pluma de 100 UI/mL |
| estreptomicina | | 100 μg/mL de estreptococo |
| Gentamicina (50 mg/mL de stock) | 20 μL | 20 μg/mL |
Tabla 2. Composición de los medios de crecimiento de células gliales
| Componentes | Volumen a añadir | Concentración final |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Suero fetal bovino (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicilina-estreptomicina (100x) | 500μL | 100 UI/mL (pluma) |
| 100 μg/mL (estreptococo) | | |
| Gentamicina (50 mg/mL de stock) | 20 μL | 20 μg/mL |
| GDNF (10 μg/mL de culata) | 50 μL | 10 ng/mL |
