Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Purificación de capilares cerebrales porcinos
- Recoja de 8 a 10 cerebros de cerdos domésticos de 5 a 6 meses de edad (por ejemplo, de un matadero cercano) y transpórtelos en hielo al laboratorio. Recomendamos iniciar el siguiente procedimiento de purificación dentro de las 2-3 horas posteriores a la terminación del animal.
- Coloque los sesos en un banco de flujo estéril y lávelos suavemente con 1 L de PBS en un vaso de precipitados colocado sobre hielo.
- Retire cuidadosamente las meninges de un cerebro a la vez con pinzas de punta fina y transfiera los cerebros sin meninges a otro vaso de precipitados de 1 L con PBS colocado en hielo. Prolongar el tiempo necesario puede complicar la eliminación. El tiempo aproximado utilizado para cada cerebro debe ser de 10-15 min.
- Con un bisturí, raspe la materia gris de un cerebro a la vez y transfiera el material aislado a placas de Petri (8,8 cm2) que contengan 20 ml de mezcla de nutrientes DMEM F-12 (DMEM/F-12) colocada en hielo. Aísle la mayor cantidad posible de materia gris sin extraer material de materia blanca. Para la fragmentación inicial, pase el material de materia gris a través de una jeringa de 50 ml sin aguja. Continúe por todos los cerebros y agrupe el material de materia gris recolectado. Prolongar el tiempo necesario puede complicar la eliminación. El tiempo aproximado utilizado para cada cerebro debe ser de 10-15 min.
- Transfiera el material de materia gris aislado al tubo de molienda de un homogeneizador de tejido manual en una proporción de 50/50 con medios DMEM/F-12. Homogeneice el material haciendo 8 trazos hacia arriba y hacia abajo con un mortero suelto, seguidos de 8 trazos hacia arriba y hacia abajo con un mortero apretado. Continúe hasta que todo el material aislado se haya homogeneizado, luego transfiera el homogeneizado a una botella de 500 mL y diluya con DMEM/F-12 hasta aproximadamente 450 mL de volumen total.
- Filtre el homogeneizado con un frasco de tapa azul de 500 ml con soporte de filtro y malla filtrante de 140 μm, y aísle los capilares pasando el tejido a través del filtro. Utilice un filtro por cada 50 mL de homogeneizado y lave cada filtro con DMEM/F-12 posteriormente.
- Coloque los filtros que contienen capilares en placas de Petri con una solución de digestión de tripsina/EDTA (2,5 % de tripsina, 0,1 nM de EDTA en PBS), colagenasa CLS2 (2.000 U/mL) y DNasa 1 (3.400 U/mL) en DMEM/F-12. Utilice 1 placa de Petri (8,8 cm2, solución de 20 ml) por cada 3 mallas filtrantes.
- Coloque las placas de Petri a 37 °C durante 1 h en un agitador orbital a 180 rpm o revuélvalas suavemente cada 10 minutos. Después de 1 h, lave los capilares de los filtros con suspensión de la placa de Petri con una pipeta de 1 mL.
- Divida la suspensión de los 3 platos en 2 tubos de 50 mL y detenga la digestión agregando 10 mL de DMEM/F-12 a cada tubo de 50 mL.
- Centrifugar las suspensiones celulares a 250 x g, 4 °C durante 5 min. Aspirar los sobrenadantes y volver a suspender cada pellet en 10 mL de DMEM/F-12. Añada 20 mL adicionales de DMEM/F12 a cada tubo. Repita este paso de centrífuga dos veces.
- Deje que los tubos se enfríen en hielo durante 5 minutos y transfiera las soluciones a 2 tubos nuevos de 50 ml.
- Centrifugar las suspensiones celulares a 250 x g, 4 °C durante 5 minutos, y volver a suspender cada pellet en 8 - 10 mL (aproximadamente 1 mL/cerebro utilizado) de solución de congelación que consiste en 10% de DMSO en FBS.
- Transfiera la suspensión celular a crioviales, utilizando 1 mL por criovial. En promedio, la purificación da como resultado 1 vial por cerebro utilizado, proporcionando en promedio células endoteliales para 12-16 insertos. Coloque los viales en una caja de congelación a -80 °C durante al menos 4 h hasta toda la noche. A continuación, almacene los crioviales en un criotanque con nitrógeno líquido.
cautela: El nitrógeno líquido tiene temperaturas extremadamente bajas. Por favor, use la protección adecuada.