Un método para el aislamiento de unidades neurovasculares a partir de cerebro de rata

Resumen

Fuente: Brzica, H., et al,. Un método sencillo y reproducible para preparar muestras de membrana a partir de microvasos cerebrales de rata recién aislados. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra el proceso de aislar microvasos cerebrales de ratas sacrificadas. Incluye la disección del cerebro, la limpieza del tejido y la digestión mecánica, seguida de una centrifugación repetida para aislar la fracción pura de los microvasos.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto. El flujo de procedimiento para el protocolo se muestra en la Figura 1.

1. Configuración para el procedimiento

1. Prepare el tampón de microvasos cerebrales (BMB). Comience pesando 54,66 g de D-manitol, 1,90 g de EGTA (ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N,N',N'-tetraacético) y 1,46 g de base de 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (es decir, Tris) en un vaso de precipitados limpio. Añadir 1,0 L de agua desionizada. Mezcle los componentes del tampón BMB con un agitador magnético. Una vez que la solución se haya mezclado completamente, ajuste el pH a 7.4 usando 1.0 M HCl.
2. Prepare una solución de dextrano al 26% (MW 75,000) (p/v) antes de anestesiar a los animales. Siga los siguientes pasos para preparar la solución de dextrano.
   nota: Es de vital importancia preparar esta solución con anticipación porque el dextrano puede tardar aproximadamente 1,5-2 h en disolverse en un tampón acuoso.
   1. Pese el dextrano en polvo (26 g por 100 ml de tampón) en un vaso de precipitados limpio.
   2. Mida el volumen adecuado de BMB y explíquelo en un vaso de precipitados limpio y separado.
   3. Vierta lentamente BMB en el vaso de precipitados que contiene dextrano en polvo. Durante el vertido de BMB, mezcle manualmente el dextrano en polvo con una varilla de agitación de vidrio.
   4. Ajuste el pH a 7.4 con 1.0 M HCl inmediatamente antes de usar.
      nota: Un aislamiento típico de microvasos cerebrales de 12 ratas Sprague-Dawley individuales (macho o hembra; 3 meses de edad; 200-250 g cada una) requiere 200 mL de solución de dextrano (es decir, 52 g de dextrano en 200 mL de BMB).

>2. Extracción de tejido cerebral de ratas Sprague-Dawley

1. Después del tratamiento experimental deseado, anestesiar ratas Sprague-Dawley con ketamina (50 mg/kg; 2,5 mL/kg i.p.) y xilacina (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I,p.). Diluir ketamina y xilacina en solución salina al 0,9% hasta concentraciones finales de 20 mg/mL y 4,0 mg/mL, respectivamente. Sacrificar animales por decapitación utilizando una guillotina afilada de acuerdo con las directrices del IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales). Utilice el mismo procedimiento para las ratas Sprague-Dawley macho y hembra.
2. Reseca la piel del cráneo de rata haciendo un solo corte transversal con unas tijeras quirúrgicas.
3. Con rongeur, retire con cuidado la placa del cráneo y exponga el cerebro.
4. Retire el cerebro con una espátula. Separe el cerebro y coloque el tejido cerebral aislado en un tubo cónico de 50 mL que contenga 5 mL de BMB. Añadir 1,0 μL de cóctel de inhibidores de la proteasa por 1,0 mL de tampón BMB inmediatamente antes de su uso.

>3. Procesamiento cerebral

1. Transfiera el tejido cerebral del tubo cónico de 50 ml a una placa de Petri limpia.
2. Con unas pinzas, haga rodar suavemente el cerebro sobre papel de filtro de 12,5 cm de diámetro para eliminar las meninges externas, que están adheridas sin apretar a la corteza cerebral. Presione suavemente el tejido cerebral contra el papel de filtro y vuelva a enrollar el pañuelo. Gire el papel de filtro con frecuencia durante este paso.
3. Separe el plexo coroideo de los hemisferios cerebrales con fórceps.
   nota: El plexo coroideo aparece como un tejido membranoso claro localizado en la superficie de los ventrículos cerebrales.
4. Aplana suavemente el tejido cerebral y retira las meninges y los bulbos olfativos restantes con unas pinzas.
5. Coloque el tejido cerebral cortical en un mortero de vidrio frío. Añadir 5,0 mL de BMB que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa al mortero.
6. Usando un homogeneizador de potencia en la cabeza, homogeneice el tejido cerebral usando 15 carreras hacia arriba y hacia abajo a 3,700 rpm. Realice la homogeneización con un triturador de papel tisú de mortero de 10 mL. Entre la homogeneización de cada muestra individual, limpie el mortero con etanol al 70%
   nota: Los trazos de homogeneización deben ser consistentes en términos de ritmo y magnitud.
7. Vierta el homogeneizado en tubos de centrífuga etiquetados.

>4. Pasos de centrifugación

1. Agregue 8.0 mL de solución de dextrano al 26% a cada tubo de centrífuga marcado que contenga homogeneizado cerebral.
2. Invierta el tubo dos veces y luego vórtice completamente la muestra. Lleve a cabo el vórtice de cada muestra utilizando múltiples ángulos para asegurar una mezcla completa de la solución de homogeneizado cerebral con la solución de dextrano al 26%.
3. Centrifugar muestras a 5.000 x g durante 15 min a 4 °C.
   nota: Para algunos análisis, es útil comparar los microvasos cerebrales con el parénquima cerebral. En caso de que se requiera la evaluación de la expresión de proteínas en el parénquima cerebral, el sobrenadante de esta etapa de centrifugación (es decir, la fracción del parénquima cerebral) puede recogerse y almacenarse a -80 °C para su uso futuro.
4. Retire el sobrenadante con un aspirador de vacío y una pipeta Pasteur de vidrio.
   nota: Se debe tener cuidado de no alterar el pellet. De lo contrario, se reducirá la cantidad de microvasos cerebrales recolectados, lo que disminuirá significativamente la producción de proteínas de este procedimiento.
5. Vuelva a suspender el pellet en 5,0 mL de cóctel de inhibidores de la proteasa que contiene BMB (es decir, 1,0 μL de cóctel de inhibidores de la proteasa por 1,0 mL de tampón BMB). Agite el pellet para asegurar una mezcla completa.
6. Agregue 8.0 mL de dextrano al 26% a cada tubo de centrífuga y vórtice como se describe en los pasos 4.1-4.2 de este protocolo.
7. Centrifugar muestras a 5.000 x g durante 15 min a 4 °C.
8. Con un matraz de vacío y una pipeta de vidrio, aspire el sobrenadante y asegúrese de que la pelliza que contiene el microvaso cerebral no se rompa.
   nota: El exceso de material que se ha adherido a la pared del tubo no contiene microvasos y debe limpiarse y eliminarse cuidadosamente.
9. Repita los pasos 4.5 a 4.8 dos veces más.
10. Una vez que se hayan completado los 4 pasos de centrifugación de dextrano, agregue 5.0 mL de BMB a cada pellet y vórtice para resuspender la muestra><. nota: Una vez completado el paso 4.10, se pueden recolectar microvasos completos para analizar la localización de proteínas. Esto se puede lograr tomando una alícuota de 50 μL de gránulo de microvaso resuspendido y untándola en un portaobjetos de microscopio de vidrio. A continuación, los microrecipientes se fijan térmicamente a 95 °C durante 10 min en un bloque calefactor, seguido de la fijación en etanol helado durante 10 min. A continuación, los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C hasta que se necesiten para estudios de imagen.

Resultados

Figura 1: Esquema de procedimientos y protocolos para aislar microvasos cerebrales de rata y preparar muestras de membrana

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cóctel de inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich	#P8340	Componente del tampón de microvasos cerebrales
D-manitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Componente del tampón de microvasos cerebrales
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Componente del tampón de microvasos cerebrales
Base Trizma	Sigma-Aldrich	#T1503	Componente del tampón de microvasos cerebrales
Dextrano (75.000 MW)	Espectro Químico Mftg Corp	#DE125	Dextrano utilizado en las etapas de centrifugación para separar los microvasos del parénquima cerebral
Zetamina	MWI Sanidad Animal	#501072	Anestésico general
Xilacina	Suministro Médico del Oeste	#5530	Anestésico general
Solución salina al 0,9%	Suministro Médico del Oeste	N/A	Diluyente anestésico general
Papel de filtro (12,5 cm de diámetro)	VWR	#28320-100	Se utiliza para la extirpación de meninges del tejido cerebral
Tubos de centrífuga	Sarstedt	#60.540.386	Tubos desechables utilizados para las etapas de centrifugación de dextrano
Ensayo Pierce™ Coomassie Plus (Bradford)	ThermoFisher Scientific	#23236	Medición de la concentración de proteínas en preparaciones de membrana
Homogeneizador de potencia aérea Wheaton	DWK Ciencias de la Vida	#903475	Necesario para la homogeneización de muestras
Molinillo de papel tisú de mortero de vidrio de 10,0	DWK Ciencias de la Vida	#358039	Necesario para la homogeneización de muestras
ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	#H1758	Necesario para el ajuste del pH de los tampones
Pinzas estándar	Herramientas de Bellas Ciencias	#91100-12	Se utiliza para la disección del tejido cerebral
Friedman-Pearson Rongeurs	Herramientas de Bellas Ciencias	#16020-14	Se utiliza para abrir el cráneo para aislar el cerebro
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml	ThermoFisher Scientific	#352070	Se utiliza para la recolección de tejido cerebral después del aislamiento
Pipetas de vidrio Pasteur	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Se utiliza para la aspiración de desechos celulares después de los espines de dextrano
Etanol anhidro	Sigma-Aldrich	#459836	Se utiliza para limpiar el molinillo de pañuelos; diluido al 70% con agua destilada
ketamina
Cubitera

ml