Generación de neuronas piramidales corticales a partir de células madre neurales humanas

Resumen

Fuente: Gouder, L., et al,. Cuantificación tridimensional de espinas dendríticas a partir de neuronas piramidales derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas. J. Vis. Exp. (2015)

Este video describe un método para preparar cubreobjetos de vidrio recubiertos con poliornitina y laminina para mejorar la adhesión y el crecimiento de las células madre neurales. La técnica implica incubaciones y lavados secuenciales, lo que facilita la formación de una matriz de soporte que promueve el crecimiento y la diferenciación de las células neuronales, imitando las estructuras que se encuentran en las neuronas.

Protocolo

1. Cultivo Neuronal
   nota: La reprogramación de fibroblastos en células madre pluripotentes, el compromiso con el linaje del telencéfalo dorsal, la derivación, la amplificación y el banco de progenitores corticales tardíos (LCP) se describieron en Boissart et al. La diferenciación neuronal de las células similares a LCP también se realizó según Boissart et al con ligeras modificaciones. Se han desarrollado otros procedimientos para la reprogramación directa de fibroblastos en células madre pluripotentes inducidas, seguida de su diferenciación en neuronas. Este protocolo se mantuvo ya que permite la producción selectiva de neuronas glutamatérgicas piramidales.
   1. Tratar las placas de cultivo de 6 pocillos con cubreobjetos de vidrio con poli-ornitina (diluida a 1/6 en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco), concentración de stock 0,01%) O/N, seguido de tres lavados en DPBS. A continuación, añada laminina (concentración de stock de 1 mg/ml, diluida 500 veces en DPBS) durante al menos 10 horas bajo la campana de flujo.
   2. Placa y envío de NSC a baja densidad (50.000 células/^cm2) en placas de cultivo de 6 pocillos con cubreobjetos de vidrio en 3 ml de medio de cultivo compuesto por DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/F12 (500 ml), 2 viales (5 ml cada uno) de suplemento N2, 2 viales (10 ml cada uno) de suplemento B27, 10 ml de Pen-Estreptomicina (Penicilina = 10.000 unidades/ml y Estreptomicina = 10.000 unidades/ml), 1 ml de 2-mercaptoetanol (Solución madre: 50 mM) y laminina (1/500), sin factores de crecimiento. PASO CRÍTICO: Lleve a cabo este paso con cuidado agregando celdas con movimientos de rotación lentos para reducir la agrupación de celdas.
   3. Retire el medio de cultivo. Añadir medio N2B27 fresco que contenga 2 μg/ml de solución de laminina fresca para mantener la neurona adherida a los cubreobjetos de vidrio y evitar la formación de grumos. Cambie el medio cada 3 días. Guarde un poco del medio restante (200 μl) antes de agregar medio fresco para evitar que la célula se seque. Alternativamente, proceda rápidamente y cambie el volumen total (3 ml).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PD-PBS (1X), sin Calcio, Magnesio y Rojo de Fenol	Gibco/ Tecnologías de Vida	14190169
Biorreactivo en solución de poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	P4957
Laminina de ratón	Dutscher Dominique	354232
Suplemento N2	Gibco/ Tecnologías de Vida	17502048
B-27 Suplemento sin vit A (50X)	Gibco/ Tecnologías de Vida	12587010
DMEM/TUERCA. MEZCLA F-12 CON GLUT-I	Gibco/ Tecnologías de Vida	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Tecnologías de Vida	21103049
2-mercaptoetanol	Gibco/ Tecnologías de Vida	31350-010
Pen-Steptomycin	Gibco/ Tecnologías de Vida	Números 15140-122
Cubreobjetos 13 mm	VWR	631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI	Gibco/ Tecnologías de Vida	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, Líquido Viscoso	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Fibroblastos humanos	Biorrepositorio de líneas celulares de Coriell	GM 4603 y GM 1869	Instituto Coriell de Investigación Médica, Camden, Nueva Jersey, EE. UU.
Incubadora de CO2
6 placas de cultivo de pocillos
Piptette