Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Preparación y extracción del cerebro del ratón para cortarlo
- Prepárese para la incubación de la perfusión y el corte.
- Aproximadamente 30 minutos antes de cortar, prepare una solución de corte con alto contenido de sacarosa y líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) con bajo contenido de calcio para la incubación de la rebanada antes del registro o la toma de imágenes.
- Coloque todas las herramientas necesarias (tijeras grandes de punta roma, tijeras de resorte pequeñas, pinzas anatómicas, tijeras grandes o guillotina, tijeras de iris, pinzas de joyero, jeringa de 10 ml con aguja de 27G x 1/2 pulgada, un trozo pequeño de papel de filtro de 1 cm x 2 cm y una pipeta Pasteur con punta rota para la transferencia de rebanadas) para la perfusión y el corte, y preparar la bandeja de perfusión.
- Montar una cámara de incubación con aCSF oxigenado en un baño de agua a 32 oC y una placa de cultivo llena de solución de corte.
- Prepare la etapa de corte para el corte en rodajas.
- Corta un pequeño trozo de agar al 3% de aproximadamente 1 cm3 para usarlo como respaldo para el cerebro y 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm para una protuberancia que se usará para apuntalar el colículo inferior (CI).
- Pegue el tope trasero en el escenario con adhesivo de cianocrilato, así como la protuberancia en el lado derecho del tope trasero de manera que formen un ángulo de 80°.
- Extirpa el cerebro.
- Anestesiar profundamente a un ratón postnatal día 12 a día postnatal 20 (p12-p20, idealmente p14-18) con ketamina 100 mg/kg y xilaxina 3 mg/kg (o procedimiento comparable aprobado por el comité de ética)
nota: Confirme el nivel adecuado de anestesia a través de la falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie. Como el animal está bajo anestesia brevemente, no es necesario el ungüento oftálmico.
- Con unas tijeras romas, exponga la caja torácica de la apófisis xifoides al cuello.
- Encuentra la apófisis xifoides y haz un corte horizontal de aproximadamente 1,5 cm.
- Realiza dos cortes verticales desde los extremos del corte horizontal anterior hasta los hombros, de aproximadamente 1,5 cm cada uno.
- Corta a través del diafragma y las uniones costocondrales para exponer el corazón.
- Con unas tijeras de resorte pequeñas, haga un corte pequeño de 2 a 5 mm en la aurícula derecha, desde el lado ventral hasta el dorsal del corazón.
- Usando una jeringa de 10 ml con una aguja de 27G x 1/2 pulgada, inyecte el ventrículo izquierdo y perfunda rápidamente al animal con una solución de corte con alto contenido de sacarosa.
- Una vez que la sangre salga clara, use unas tijeras más grandes para quitar la cabeza.
nota: No se ha evaluado sistemáticamente la utilidad de la perfusión. Sin embargo, en nuestra experiencia, la perfusión transcardíaca en ratones tan jóvenes se puede realizar con casi el 100% de éxito, y tiene el beneficio de eliminar los glóbulos rojos, que pueden emitir fluorescencia e interferir con las imágenes.
- Corta la piel a lo largo de la línea media para exponer el cráneo.
- Con unas tijeras de iris dobladas, corte el cráneo entre los ojos, luego, comenzando desde el corte entre los ojos, corte cuidadosamente de anterior a posterior a lo largo de la sutura de la línea media teniendo cuidado de no dañar el cerebro por debajo
nota: Por lo general, la duramadre se desprende con el cráneo. Si es necesario, retire la duramadre antes de extraer cuidadosamente el cerebro.
- Con pinzas de joyero, abra el cráneo y extraiga el cerebro con cuidado, luego colóquelo en una solución de corte. Tenga cuidado de no dañar las cortezas.
>2. Preparando el cerebro para cortar
- Preparando el cerebro para el montaje en la etapa de vibratome.
- Usando un portaobjetos marcado con dos líneas a 90o y una línea diagonal a 17o desde la parte superior izquierda hasta la parte inferior derecha, cruzando donde se unen las dos líneas, coloque el cerebro con el lado dorsal hacia arriba, con una cuchilla de afeitar, retire 2-4 mm del cerebro del extremo rostral creando una superficie plana.
- Coloque el cerebro con la luna hacia arriba sobre la superficie plana recién creada y alinee la superficie dorsal del cerebro con la horizontal y la línea media del cerebro con la línea vertical.
- Alinee la hoja de afeitar con la línea de 17°, incline la maquinilla de afeitar en un ángulo de 30° y retire aproximadamente 3 mm de la corteza derecha en un corte diagonal doble (17° desde el plano horizontal y 60° desde la coronal).
- Montaje del cerebro en el escenario del vibrátome.
- Coloque un pequeño trozo de papel de filtro de 1 cm x 2 cm en el lado ventral del cerebro para que la dimensión larga sea perpendicular a la línea media.
- Aplique con cuidado una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato en el área frente al tope trasero (y a la izquierda del bulto).
- Coloque la cara del cerebro doble cortada en diagonal sobre el pegamento de modo que la parte caudal del cerebro y el cerebro posterior estén apoyados en la protuberancia y el lado derecho del cerebro esté contra el tope.
- Presione delicadamente el cerebro, asegurándose de que toda la superficie esté en contacto con la cámara de corte.
>3. Obtención del corte colículo-talamocortical
- Tome rápidamente la etapa de corte y colóquela en el vibrátomo, llene la etapa con solución de corte.
- Alinee la cuchilla con la parte superior (lado ventral) del cerebro.
- Retire 1-1,5 mm de la parte superior del cerebro, retire rodajas de 300-500 μm y evalúe la profundidad después de la extracción.
Nota: Cuando el CI, el cuerpo geniculado medial (MGB) y el núcleo geniculado lateral (LGN) son visibles, y el giro dentado forma una "C", tome uno o dos cortes de 600 μm. Véase la figura 1A.
- Coloque las rodajas en una cámara de retención calentada (32 oC).
