Inducción in vitro de uniones neuromusculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Resumen

Fuente:Lin, C. et al., Unión neuromuscular in vitro inducida a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas. J. Vis. Exp.(2020).

Este experimento detalla un método para generar uniones neuromusculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Utiliza un proceso de diferenciación por etapas para promover el desarrollo de miotubos y neuronas motoras y la formación de sinapsis, produciendo uniones neuromusculares funcionales.

Protocolo

1. Preparación de placas recubiertas de matriz extracelular (MEC)

1. Diluya ECM (ver Tabla de Materiales) con hielo 1x PBS hasta una concentración final de 2%
2. Agregue 1 mL de ECM a 49 mL de 1x PBS en un tubo de plástico de 50 mL. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
3. Coloque 1 cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Agregue 1.5 mL de ECM al 2% en cada pocillo.
4. Incubar la placa de pocillos con ECM al 2% durante 2 h a 37 °C.
5. Aspire el ECM de la placa de pocillos y almacene la placa a 4 °C antes de usarla.

>2. Diferenciación de las iPSCs hacia NMJ

1. Siembre 4 x 10^{5 de} iPSCs por pocillo en la placa de 6 pocillos preparada en la sección 1. Asegúrese de sembrar las células en el cubreobjetos depositado previamente en el pozo.
   nota: En este estudio se utilizó la línea celular 201B7^MYOD iPS.
   1. Retire el medio de las iPSC en la placa de cultivo de 6 cm y lave las iPSC una vez con 1x PBS.
   2. Añadir 1 mL de solución de desprendimiento de células a la placa e incubar durante 10 min a 37 °C.
   3. Agregue 3 ml de medio de células madre embrionarias (ES) de primates a la placa y pipetee suavemente 3 veces.
   4. Recoja el sobrenadante, que contiene iPSC desprendidas, en un tubo de plástico de 50 ml y centrifugue a 160 x g a 4 °C durante 5 min.
   5. Aspire cuidadosamente el sobrenadante, vuelva a suspender las iPSC en un medio de células madre embrionarias de primates de 3 mL con 10 μM Y27632 y cuente el número de células con un hemocitómetro.
   6. Diluir las iPSCs con medio de células madre embrionarias de primates y 10 μM Y27632 a una concentración de 2 x 10⁵ células/mL. Añadir 2 mL de iPSCs en el cubreobjetos predepositado en el pocillo descrito en la sección 1.

>3. Inducción de las iPSCs a NMJ

1. El día 1, 24 h después de sembrar las iPSC en la placa de 6 pocillos, retire el medio de cultivo y reemplácelo con 2 mL de medio celular ES fresco de primate que contenga 1 μg/mL de doxiciclina en cada pocillo.
2. Cambie el medio con 2 mL de medio de diferenciación miogénica (MDM) (Tabla 1) que contenga 1 μg/mL de doxiciclina (concentración final) en cada pocillo. Refresque el medio todos los días desde el día 2 hasta el día 10.
3. A partir del día 11, cambie el medio a 2 mL de medio NMJ (Tabla 1) en cada pocillo. Actualice el medio cada 3\u20124 días a partir de entonces hasta el día 30.
4. Observar la NMJ diferenciada por microscopía invertida de fase el día 30. El NMJ se puede utilizar para el siguiente análisis.

Resultados

Tabla 1: Fórmula del medio.

Medio de diferenciación miogénica (MDM)	MEM-alfa	500 ml
	100mM 2-YO	1117 μL
	doxiciclina	1 μg/mL
	Ksr	56 ml (final al 10%)
	Pluma/...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio, factores de crecimiento y reactivos
2-mercaptoetanol	Nacalai tesque	21418-42
B27, Gibco	Gibco	12587-001
BDNF	Sistemas de investigación y desarrollo	248-BD
Solución de desconexión de celdas, Accumax	Tecnologías STEMCELL	#07921
Secador de punto crítico	Hitachi	ES-2030
doxiciclina	Takara	631311
ECM, Matrigel (factor de crecimiento reducido)	Corning	356230
GDNF (en	Sistemas de investigación y desarrollo	212-GD
Gelificación, gel IP	Bastón Geno	PG20-1
Recubridor de iones	JEOL	JEC3000FC
iPSC medio, mTeSR	Tecnologías STEMCELL	85850
KnockOut SR (KSR)	Gibco	10828-028
Microscopía de células vivas	Nikon		Microscopio Eclipse Ti
MEM-alfa	Gibco	12571-071
N2, Gibco	Gibco	17502-048
Medio neurobasal	Gibco	21103-049
NT3	Sistemas de investigación y desarrollo	267-N3
Medio de células madre embrionarias de primates	ReproCell	RCHEMD001
Sem	Hitachi	S-4700
Tem	Hitachi	H7650
Y27632	Wako Chemicals GmbH	253-00513