Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Configuración experimental
- Antes de comenzar la recolección de tejidos y células, verifique que todas las herramientas estén estériles. Si es necesario, autoclave un par de tijeras quirúrgicas afiladas, un par de pinzas muy finas y un par de pinzas estándar finas. Además, según corresponda, esterilice cada sustrato antes de la siembra de células mediante esterilización UV, exposición al etanol o esterilización por vapor.
- Preparación de medios y soluciones madre para la recolección y disociación de neuronas
- Prepare el medio de Bottenstein y Sato (BS), agregando un 1% de penicilina-estreptomicina (PS) y un 1% de suplemento de N2 al medio F12 de Ham. Calcule el volumen final necesario como 500 μl por pocillo (si se utiliza una placa de 24 pocillos).
- Preparar las existencias de colagenasa IV en el medio F12 de Ham a una concentración de 1,25% en peso/v. Filtrar-esterilizar la solución y almacenar a -20 °C como alícuotas de 200 μl.
- Preparar las existencias de tripsina pancreática bovina en el medio F12 de Ham a una concentración de 2,5% en peso/v, filtrar-esterilizar y almacenar a -20 °C como alícuotas de 200 μl.
- Preparar la solución madre de factor de crecimiento nervioso (NGF) a una concentración de 5 μg/ml en una solución de 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) sin ácidos grasos (BSA) esterilizada por filtro en medio F12 y almacenar a -20 °C como alícuotas de 200 μl. No filtre el NGF después de la reconstitución.
- En caso de que no se haya realizado ninguna modificación en la superficie, recubra los cubreobjetos/placas con poli-D-lisina (0,1 mg/ml durante 15 min a temperatura ambiente [RT]) y/o laminina (2-10 μg/cm2 durante 2 horas a 37 °C) para favorecer la adhesión de las neuronas y su crecimiento, según corresponda.
- Caliente siempre el medio en un baño de agua a 37 °C antes de usarlo.
>2. Recolección y disociación de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG)
- Terminar con la rata por dislocación cervical y decapitación. Afeita a la rata y levanta la piel para exponer la columna vertebral. Con unas tijeras afiladas, extirpe la columna vertebral teniendo especial cuidado de los órganos confinados y los vasos sanguíneos. Transfiera la columna vertebral a una cabina de seguridad biológica (clase II) utilizando una placa de Petri y extraiga cualquier parte dorsal.
- Divida la columna vertebral por la mitad a lo largo del eje longitudinal con tijeras quirúrgicas estériles y afiladas para exponer el tejido de la médula. En este punto, es útil cortar la columna vertebral en dos segmentos más pequeños por debajo del nivel de la caja torácica, para que sea más fácil de manejar durante la recolección de neuronas DRG. Con pinzas finas, retire suavemente todo el tejido del cordón, prestando atención a no tirar y quitar las raíces DRG. De esta manera, el DRG y las raíces quedarán expuestas dentro de los canales vertebrales, aún encajonados en la columna. Observe los DRG como filamentos blancos que salen directamente de los canales.
- Extraiga toda la raíz DRG (no solo la DRG) de los canales vertebrales utilizando pinzas muy finas, profundizando en los canales vertebrales y prestando atención a no dañar las raíces de los ganglios. Transfiera el DRG a una pequeña placa de Petri (60mm2) que contenga 3-4 ml de medio Ham's F12 suplementado con 1% de PS. Si usa diferentes animales, use platos separados.
- Bajo un microscopio de disección, limpie el DRG de cualquier exceso de raíces nerviosas que rodeen los ganglios con pinzas estériles y un bisturí para reducir la contaminación de las células gliales. Transfiera el DRG a una placa de Petri pequeña (35 mm2) con 1,8 ml de F12 medio fresco.
- Añadir 200 μl de solución madre de colagenasa tipo IV al 1,25% en peso/v (concentración final del 0,125%) e incubar el GRD a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 hora. Aspirar cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio, prestando atención a no aspirar ni dañar el GRD. Añadir medio F12 fresco suplementado con 0,125% wt/v colagenasa tipo IV enzima e incubar durante 1 hora como se ha descrito anteriormente.
- Aspire el medio y lave suavemente el DRG con medio F12. Añadir a continuación 1,8 ml de medio F12 y 200 μl de tripsina (concentración final de 0,25% wt/v) e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 min.
- Retire la tripsina y agregue 1 ml de medio F12 suplementado con 500 μl de suero fetal bovino (FBS) para detener la reacción enzimática. Aspirar el medio y lavar suavemente el DRG con medio F12 tres veces para eliminar los restos de suero.
- Añada 2 ml de medio F12 fresco y transfiera con cuidado el DRG con el medio a un tubo de 15 ml con una pipeta de vidrio. Disocie suavemente las neuronas DRG pipeteando hacia arriba y hacia abajo (unas 8-10 veces) con la pipeta de vidrio (se pueden usar puntas de plástico como alternativa).
- Deje que el gránulo se asiente en el fondo del tubo y recoja el medio en un tubo nuevo. Añadir 2 ml de medio F12 fresco al tubo que contiene el pellet y repetir la disociación mecánica con la pipeta de vidrio. Repita este paso hasta que la suspensión se vuelva homogénea (unas 3-4 veces) y recoja todo el DRG disociado en el nuevo tubo. Este método reduce el estrés derivado de la disociación mecánica y mejora la viabilidad de las neuronas.
- Filtre la suspensión homogeneizada resultante en un nuevo tubo de 15 ml utilizando un filtro de células de 100 μm para eliminar las neuronas no disociadas y otros desechos. En esta etapa, puede ser conveniente filtrar primero la suspensión celular en un tubo de 50 ml y luego transferir la solución al tubo más pequeño usando una pipeta de vidrio. Centrifugar la suspensión a 110 g durante 5 min.
- Prepare un BSA al 15% añadiendo 500 μl de una solución de BSA al 30% a 500 μl de medio F12. Pipetea lentamente la solución por la pared de un tubo de 15 ml para crear un rastro gradual de proteínas. En esta etapa, es útil sostener el tubo en un ángulo de 45° y liberar lentamente el BSA usando los números en el tubo halcón como referencia para la "pista" de formación.
- Aspirar el sobrenadante del paso 2.10 dejando 500 μl en el fondo del tubo y resuspender el pellet celular en el mismo medio. Pipetear lentamente la suspensión a lo largo de la estela de proteínas previamente preparada en el paso 2.11 (use los números en el tubo como referencia) y centrifugar a 500 g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de medio BS modificado.
nota: El volumen para resuspender las neuronas DRG puede ser hasta el volumen real requerido, dependiendo de la concentración celular final deseada y del número de muestras a sembrar. Un animal proporcionará suficientes células para un experimento de placa de 24 pocillos.
- Incubar las muestras sembradas a 37 °C, 5% de CO2 durante 2 horas para permitir la adhesión de las células y, por último, añadir medio BS fresco suplementado con 50 ng/ml de NGF.
