Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

Resumen

Arborización dendrítica de las neuronas sensoriales de la Drosophila Larval sistema nervioso periférico son modelos útiles para dilucidar tanto generales como específicos de la clase de neuronas mecanismos de diferenciación de las neuronas. Se presenta una guía práctica para generar y analizar la arborización dendrítica de neuronas mosaicos genéticos.

Resumen

Desarrollo del sistema nervioso requiere de la especificación correcta de la posición de la neurona y de la identidad, seguido por el desarrollo neuronal dendríticas precisa específicos de la clase y el cableado axonal. Recientemente, la arborización dendrítica (DA), las neuronas sensoriales del sistema Drosophila larvas nervioso periférico (SNP) se han convertido en poderosos modelos de genética en la que para dilucidar los mecanismos generales y específicos de la clase de diferenciación de las neuronas. Hay cuatro clases principales de neuronas DA (I-IV) ^1. Se nombran en orden creciente de complejidad dendrita cenador, y que clase de diferencias específicas en el control genético de la diferenciación de ^2.10. El sistema de asimilación sensorial es un modelo práctico para investigar los mecanismos moleculares de control de la morfología dendrítica ^11-13 debido a que: 1) se pueden aprovechar las poderosas herramientas genéticas disponibles en la mosca de la fruta, 2) la DA neuronal dendrita cenador se extiende en sólo dos dimensiones por debajo de un culo ópticamentear cutícula larval lo que es fácil de visualizar con alta resolución en vivo, 3) la diversidad específica de la clase en la morfología dendrítica facilita un análisis comparativo para encontrar los elementos clave que controla la formación de los árboles dendríticos muy simple vs ramificada, y 4) dendríticas cenador estereotipadas formas diferentes de neuronas DA facilitar morfométricos análisis estadísticos.

DA actividad neuronal modifica la salida de un generador de patrones de locomoción larvas centrales ^14-16. Las diferentes clases de neuronas DA tienen distintas modalidades sensoriales, y su activación provoca diferentes respuestas conductuales ^14,16-20. Además diferentes clases enviar proyecciones axonales estereotipada en el sistema nervioso central larvas de Drosophila en el cordón nervioso ventral (VNC) ^21. Estas proyecciones terminar con representaciones topográficas de los dos DA modalidad de neurona sensorial y la posición en la pared del cuerpo del campo dendríticas ^7,22, De 23 años. Por lo tanto, el examen de las proyecciones de DA axonal puede ser utilizado para dilucidar los mecanismos subyacentes de mapas topográficos ^7,22,23, así como el cableado de un circuito simple locomoción de larvas de modulación ^14-17.

Presentamos aquí una guía práctica para generar y analizar mosaicos genéticos ²⁴ marcas a través de las neuronas DA MARCM (Análisis de mosaico con un marcador de células reprimibles) ^1,10,25 y Flp-out ^22,26,27 técnicas (que se resumen en la Fig. 1.).

Protocolo

1.Preparation de reactivos

1. Prepare Ca ^{+ +} libre HL3.1 solución salina ^28.
   1. En mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 de MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 HEPES, sacarosa 115, y trehalosa 5, pH 7,2. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
      Nota: Ca ^{+ +} sin solución impide la contracción muscular durante la disección.
2. Hacer de poli-L-lisina (PLL) cubreobjetos.
   1. Disolver 100 mg de PLL en el agua 4.2ml y hacer alícuotas 300μl en tubos Eppendorf y se congela a -20 ° C.
   2. Antes de cubreobjetos de recubrimiento, descongelar primero una parte alícuota, traerlo hasta 10 ml en _ddH2O y añadir 20μl de Kodak Photo-Flo, la concentración de PLL final es de 0,7 mg / ml.
   3. Cubreobjetos sumergir por 30 minutos en una solución de PLL, eliminar y seco, luego enjuague a fondo con agua y seca. Repita dos veces. Cubreobjetos tratados con una duración aproximada de un mes.

2. Cruces genéticos

1. To generar clones MARCM. Aquí está una cruz de ejemplo utilizando un controlador de pan-DA ^11,27:
   FRT2A x hsFLP; Gal4 ^{109 (2) 80,} UAS-mCD8:: GFP, bañera-GAL80 FRT2A/SM5-TM6B
2. Para generar Flp-out clones. Aquí está una cruz de ejemplo utilizando una clase IV controlador específico ^8:
   ppk-Gal4 x yw, hsFLP; UAS-FRT-CD2, y ^{+-stop-FRT-mCD8::} GFP

3. Recolección de los embriones

1. Mantenga cruza Drosophila en una botella de colección a 25 ° C y recoger los embriones en una placa de agar jugo de manzana ²⁹ se extendió con una fina capa de pasta de levadura ^30,31.

4. Tratamiento de choque de calor de los embriones

1. Coloque un plato vacío en la oposición a la placa de agar de jugo de manzana en la que los embriones se han establecido. Selle alrededor de estas dos placas con Parafilm (Fig. 2).
2. Durante el choque térmico, se sumergen ªplaca e en el baño de agua y se mantiene presionado con un peso de metal.
3. Para los embriones MARCM
   1. Recoger los embriones durante 2 e incubar en un plato de petri de 10 cm rodeado por tejidos humedecido a 25 ° C durante 2 horas una adicional.
      Nota: Ajuste del protocolo de choque térmico altera la frecuencia con que se generan clones.
   2. Para un número menor de clones, con el objetivo de una sola neuronas aisladas, sumergirse y golpe de calor en el baño de agua durante 1 hora a 38 ° C.
   3. Para un mayor número de clones, choque térmico de 45 minutos a 38 ° C, a temperatura ambiente 30 minutos recuperarse, luego de choque térmico de nuevo durante otros 30 minutos.
4. Recoger Flp-los embriones durante 24 horas, y el choque térmico de 1 hora a 38 ° C.

5. La detección de los clones

1. Después del choque térmico, retire la tapa de la disposición hermético y coloque el jugo de manzana placa de agar en una placa de Petri de 10 cm rodeado por tejidos húmedos. La cultura los embriones y larvas posteriores a 25 ° C hasta que vaganING 3 ^º estadio.
   Nota: las condiciones de cultivo, en especial la alimentación, se han mostrado alteraciones en la morfología DA dendríticas cenador ^32,33. Asegúrese de que las larvas en crecimiento tienen el acceso a la pasta de levadura en todo momento, controlar y reponer la pasta de levadura según sea necesario.
2. Desde este punto en adelante, en el protocolo, manipular con cuidado las larvas de insecto con unas pinzas.
3. En pocas palabras y enjuague suavemente las larvas en el agua del grifo, y luego colocar en una placa de agar.
   Nota: Este paso reduce el fondo de autofluorescencia de los alimentos o la suciedad en la superficie de las larvas.
4. Examinar las larvas bajo un microscopio de fluorescencia de gran alcance de disección. Identificar las larvas con GFP-positivas las neuronas / células en la pared del cuerpo.

6. Imágenes in vivo de las dendritas

1. Lugar de la larva en un portaobjetos de vidrio depresión con una pequeña gota de un 80% de glicerol. Coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos para inmovilizar la larva. Asegúrese de que no quede aire entre la larva y el coverslip.
2. Empuje suavemente el cubreobjetos para rodar la larva para permitir la visualización de la neurona de interés. La imagen de la mCD8:: GFP-etiquetados cenador dendríticas a través de microscopía confocal.

7. Disección de las larvas

Tenga en cuenta antes de empezar: las dendritas de neuronas DA se degradan rápidamente después del inicio de la disección. Diseccionar cada larva individual en menos de 5 minutos para asegurar una buena morfología dendrítica.

1. Diseccionar vagando ³ de larvas en un plato Sylgard como se describió previamente ³⁴ con las siguientes modificaciones:
   1. Para la obtención de imágenes de las neuronas DA axón termini, asegúrese de que el SNC está intacta y los nervios segmentarios no están rotos. Después de la apertura de las larvas, primero corte cuidadosamente las conexiones de la tráquea a la pared del cuerpo y luego retire con cuidado el intestino completo.
   2. Si las dendritas imágenes solo, eliminar el sistema nervioso central para permitir a un plano de montaje.

8. Fixation y el bloqueo de los filetes de larvas

1. Con la larva sigue clavado en la placa Sylgard, fijarlo en el 4% PFA en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador girar suavemente.
2. Eliminar los restos de tejidos larvarios (grasa corporal, la tráquea, etc) después de la fijación.
3. Lave en PBST (PBS con 0,1% Triton X-100) a 10 minutos 3 veces en la placa de Sylgard y agitador. Si el examen de terminales del axón, mantenga el filete en el plato Sylgard. (Si las dendritas tinción es posible la transferencia de los filetes de las larvas a un tubo de 0,5 ml en esta etapa ³⁴⁾
4. Bloquear las larvas por 20 minutos a temperatura ambiente en el 5% de suero normal de burro (NDS) en PBST en un agitador.

9. Tinción de los filetes de larvas

1. Retire la solución de bloqueo y se incuban en anticuerpo primario (en el 5% NDS / PBST) durante la noche a 4 ° C en un pequeño recipiente Tupperware rodeado por tejidos humedecido.
2. Retire los tubos de 4 ° C e incubar una hora más a temperatura ambiente.
3. Lavado de 10 minutos 6 veces en PBST. Agregue el antib secundariaody (en el 5% NDS / PBST), y la cubierta para evitar la foto-blanqueo fluoróforo ^34.
4. Incubar ya sea a temperatura ambiente durante dos horas, o durante la noche a 4 ° C, seguida de una hora a temperatura ambiente.
5. Lave el 10 minutos larvas 6x en PBST y proceder al montaje.

10. Montaje de los filetes de larvas para el examen de la glorieta dendrita

1. Monte cada filete de larvas lo más plana posible utilizar unas tijeras de disección o un bisturí para cortar la cabeza (incluyendo los ganchos de la boca), y la posterior (incluyendo los espiráculos) ^34.
2. Coloque los filetes de larvas en la diapositiva de la cutícula hacia abajo, monte en el 80% de glicerol, y el sello de los lados del cubreobjeto con esmalte de uñas para un "rápido" de montaje ^34.
3. Para un montaje permanente y una imagen más clara
   1. Coloque el filete de músculo diseccionado larvas hacia abajo en una gota de PBS en un cubreobjetos PLL, rápidamente se adhieren a la cubreobjetos.
   2. Eliminar tanto líquido como sea posible después del montaje, however No deje que se seque por completo.
   3. Tomar el cubreobjetos (con filete de larvas adjunta) a través de una serie de etanol: 35% de etanol, seguido de 50%, 70%, 95% y el 100% de etanol, finalmente 2x cada uno durante 10 minutos (debe ser el segundo al 100% la solución EtOH cambiar con frecuencia ) y, por último, lavar 2-3x 10 minutos en xileno.
   4. Ponga una gota de DPX medio de montaje (xileno Distyrene plastificante) en un portaobjetos limpio y coloque cuidadosamente el cubreobjetos filete hacia abajo en la parte superior. Mantener en la oscuridad, y esperar un día para el DPX para establecer antes de exponer.

11. Montaje de los filetes de larvas para el examen de las terminales del axón

1. Mantener los nervios segmentarios que corre entre el SNP y el SNC intacto durante la disección, fijación y tinción para permitir la localización de los axones de las células sensoriales periféricas del cuerpo de la neurona VNC.
2. Monte cada filete de cutícula larval hacia abajo en glicerol al 80% en una diapositiva de la depresión. Rastro de los axones del cuerpo celular de la DAVNC en el microscopio confocal. Nota: las neuronas SNP en cada proyecto el cuerpo segmento de la pared en el segmento de cognado de la VNC.

12. Los resultados representativos:

Los resultados representativos se muestran en las figuras 3-5. Fig. 3 muestra la glorieta completa de una clase IV da la neurona, capturado en vivo bajo el microscopio confocal. Fig. 4 muestra un primer plano de parte de la glorieta dendrita de una neurona inmunohistoquímica etiqueta de clase III que se ha fijado correctamente para preservar la morfología. Los asociados recuadro muestra la degradación que puede ocurrir después de una disección y fijación sin éxito (ambos se tiñeron con anticuerpos anti-GFP). Fig. 5 muestra una sola clase IV terminal axonal en el SNC (anti-GFP, verde), todos los terminales de clase IV son co-teñidas con anti-CD2 (magenta).

Figura 1 Descripción general de Protocolo. a) Recoger y embriones de choque de calor. b) Seleccione una larva con una GFP-positivas las neuronas DA clon, a continuación, la imagen de la GFP-etiquetados dendrita cenador en la larva en vivo. c) Disección de la larva, y luego inmunohistoquímica mancha el filete. d) Monte el filete de colores, y luego la imagen de la glorieta dendríticas y proyecciones axonal de las neuronas DA de los clones.

Figura 2: Preparación de la placa de agar de jugo de manzana para el choque térmico. Tome la placa (flecha blanca, ab), añadir una segunda placa de Petri en la parte superior (rojo flecha B) y el sello alrededor con Parafilm (flecha azul, b).

Figura 3 en la imagen in vivo de la glorieta de una dendrita mCD8:: GFP-etiquetados clon MARCM (genotipo como en 2.1) que representa una clase IV (v'ada) las neuronas de una larva de 3 ^º estadio. Barra de escala es 50 micras.

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Figura 4 mCD8:: GFP-etiquetados MARCM clon de una neurona de clase III (ddaA) teñidas con anticuerpos anti-GFP, mostrando la morfología buen éxito después de la disección y fijación (verde). El recuadro muestra la degradación de las dendritas (flechas blancas) que ocurren después de la disección y fijación sin éxito (magenta). Barra de escala es 25μm.

Figura 5 El ³ de estadio larval VNC. Un clon Flp-de una sola clase axón terminal VI (VDAB) (genotipo como en el punto 2.2) se detecta el uso de anticuerpos anti-GFP (verde). Anti-CD2 etiquetas de toda clase IV termini (magenta). Barra de escala es 25μm.

Discusión

La Drosophila larvas DA modelo de neurona ofrece un excelente sistema genético para investigar los mecanismos que controlan la morfología neuronal y la formación de circuitos. MARCM se utiliza generalmente para el etiquetado y para la generación de mutantes DA clones neurona. Para MARCM que utilizar un pan-neural (por ejemplo, Gal4 ^C155) o DA neuronal específica del controlador. Utilizando un controlador de pan-neuronal, es posible utilizar directamente varias poblaciones ampliamente...

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
SZX16 fluorescencia microscopio de disección (con GFPHQ filtro)	Olimpo	SZX16
Pinzas de insectos en vivo	FST	26030-10
26mm x 76mm depresión de diapositivas de vidrio	Toshinriko Co.	T8-R004
Sylgard 184 (o Silpot 184)	Dow Corning	3097358-1004
Poli-L-lisina	Sigma	P-1524	Este producto ha demostrado ser más eficaz
DPX medio de montaje	Sigma	44581
De conejo anti-GFP	Invitrogen	A-11122	Dilución 1:500
Rata anti-CD8	Caltag	5H10	Dilución de 1:200
Mouse anti-CD2	AbD serotec	MCA443R	Dilución 1:700
Anti-ratón Fasciclin2	DSHB	1D4	Dilución 1:10