>1. Mantenimiento de células madre
NOTA: El protocolo de mantenimiento celular descrito a continuación se aplica a las células madre pluripotentes (PSCs) mantenidas en una monocapa adherente. Los medios, otros reactivos y placas de cultivo celular utilizados antes del tratamiento con dimetilsulfóxido (DMSO) se pueden ajustar según sea necesario. Para todos los siguientes protocolos en este manuscrito, las células deben ser manipuladas bajo un gabinete de seguridad biológica.
- Cubra placas estériles de 6 pocillos, tratadas con cultivo de tejidos, con una matriz o sustrato calificado para células madre pluripotentes preparadas según las instrucciones del fabricante e incube durante al menos 1 h en una incubadora de CO2 (5% de CO2, atmósfera húmeda). Las placas recubiertas se pueden envolver con film y almacenar a 4 °C durante un máximo de una semana.
- Descongele las PSC criopreservadas en un baño de agua a 37 °C. Esterilice el vial con etanol antes de introducirlo en el gabinete de seguridad biológica, luego transfiera inmediatamente las células mediante pipeteo a un tubo cónico estéril que contenga de 5 a 10 volúmenes de medios de células madre precalentados.
- Centrifugar las celdas a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Aspire el medio y vuelva a suspender suavemente el gránulo celular en 1 mL de medio de células madre suplementado con un inhibidor de la proteína cinasa asociada a rho (ROCK) de 10 μM, como Y-27632.
- Aspire la matriz de cultivo de la placa y siembre las células a la densidad deseada, generalmente 0.5-1 x 106 celdas por pocillo en al menos 2 mL de medio de células madre por pocillo.
nota: La densidad de recubrimiento puede variar entre diferentes líneas celulares y clones y debe optimizarse en consecuencia.
- Mantenga las células reemplazándolas con medios de células madre precalentados diariamente. Divida las células con una confluencia aproximada del 70%-80% o cuando las colonias celulares comiencen a hacer contacto.
- Para dividir las células, aspire el medio y lave las células una vez con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Incubar las células con 1 mL de una solución de enzima de disociación por pocillo durante 5-10 minutos a 37 °C.
- Lave y vuelva a suspender las células con medios de células madre precalentados y transfiéralos a un tubo cónico estéril con 5-10 volúmenes de medios de células madre. Siga los pasos 1.3-1.7 para colocar las celdas.
>2. Pretratamiento DMSO
NOTA: Al sembrar las células para el pretratamiento con DMSO antes de la diferenciación, la densidad de células de siembra inicial debe optimizarse teniendo en cuenta la tasa de crecimiento típica de la línea de células madre, así como el protocolo de diferenciación que se utiliza. Validar la pluripotencia utilizando marcadores convencionales, según sea necesario. Las células deben pasar al menos 1x-2x después de la descongelación inicial antes de la diferenciación.
- Diferenciación de la cultura 2D
- Cuando las células alcancen una confluencia adecuada, prepare placas recubiertas, disocie las células y prepare una suspensión unicelular como se describió anteriormente.
- Cuente las células vivas usando un hemocitómetro o un contador automático de células que incluya azul de tripán u otro marcador de viabilidad.
- Coloque las células en una placa recubierta de 6 pocillos a 0,5-1 x 106 células por pocillo en un medio de células madre con el inhibidor ROCK de 10 μM.
NOTA: Para las líneas celulares probadas en nuestro laboratorio, estas densidades generalmente resultaron en un 80%-90% de células confluentes dentro del pretratamiento de DMSO de 24 horas.
- Deje incubar las células durante 24 h a 37 °C en una incubadora de CO2 (5% de CO2, atmósfera húmeda).
- Prepare DMSO al 1%-2% en medios de células madre precalentados (por ejemplo, 100 μL de DMSO en 10 mL de medio = 1% de solución de DMSO, o 200 μL de DMSO en 10 mL de medio = 2% de solución de DMSO).
- Después de 24 h de incubación, aspire el medio de las células y reemplácelo con una solución de DMSO.
- Deje que las células incuben durante 24 h a 48 h a 37 °C en una incubadora de CO2 (5% de CO2, atmósfera húmeda) antes de la diferenciación.
NOTA: Por lo general, un tratamiento de DMSO de 24 horas es suficiente en la mayoría de las líneas de células madre pluripotentes inducidas y embrionarias humanas (ESC e iPSC). Las líneas celulares con tasas de crecimiento muy lentas (tiempos de duplicación largos) pueden beneficiarse de la incubación de 48 h con DMSO. Para una incubación de 48 h con DMSO, los medios pueden sustituirse por medios de células madre frescas con DMSO al 1%-2% después de las primeras 24 h de tratamiento.
>3. Diferenciación a capas germinales primarias
NOTA: A continuación se describen los métodos que han demostrado ser efectivos en nuestro laboratorio para las PSC cultivadas en una monocapa en placas de 6 pocillos. Cualquier protocolo de diferenciación de elección debe usarse después del tratamiento con DMSO para promover la diferenciación en los linajes deseados. Retire la solución de DMSO después de un tratamiento de 24-48 h y proceda a la diferenciación siguiendo los protocolos estándar.
- Diferenciación del ectodermo
- Trate previamente las células con DMSO como se describe anteriormente para cultivos 2D.
- Prepare Noggin y SB431542 soluciones de stock.
- Prepare el medio base de diferenciación ectodérmico disolviendo el reemplazo de suero knockout (KOSR) a una concentración final del 10% en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM).
nota: Prepare suficientes medios base para 3-4 días de cambio de medios.
- Prepare los medios de diferenciación ectodérmico añadiendo Noggin a una concentración final de 500 ng/mL y SB431542 a una concentración final de 10 μM hasta el volumen adecuado de KOSR/DMEM knockout precalentado.
- Después del pretratamiento con DMSO, aspire los medios de las células y reemplácelos con medios de diferenciación (por ejemplo, 2 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos).
- Deje que las células incuben durante 3-4 días a 37 °C en una incubadora de CO2 (5% de CO2, atmósfera húmeda), reemplazando los medios diariamente con factores de diferenciación recién agregados.