Aislamiento de células progenitoras madre neurales de la región periventricular de la médula espinal de una rata adulta

Resumen

Fuente: Mothe, A., et al., Aislamiento de células madre/progenitoras neurales de la región periventricular de la rata adulta y la médula espinal humana. J. Vis. Exp. (2015).

Este video presenta un método para aislar células madre/progenitoras neurales del tejido periventricular de la médula espinal en ratas adultas. La técnica incluye la incubación de los fragmentos de tejido en una solución que contiene enzimas proteolíticas para alterar la matriz extracelular y liberar las células. Posteriormente, las células liberadas se colocan en un medio que contiene factores de crecimiento específicos que mejoran la proliferación de troncos y progenitores neurales y promueven la agregación en neuroesferas tridimensionales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

>1. Preparación de tampones de disección y medios de cultivo

1. Para el aislamiento de la médula espinal de rata, prepare 100 ml de tampón de disección (1x PBS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigere.
2. Preparar 100 ml de medio sin suero (SFM) y calentar a 37 °C. Para preparar SFM, agregue 2 mM de L-glutamina, 100 μg/ml de penicilina-estreptomicina, 2% de B27 y 10% de mezcla de hormonas al medio Neurobasal-A. Para preparar la mezcla de hormona....

Resultados

Figura 1. Laminectomía de la médula espinal de rata y disección de la región periventricular. (A) En el extremo caudal expuesto de la médula espinal, los rongeurs se insertan extraduralmente en la cara lateral del canal espinal. (B) Se hacen pequeños cortes en la lámina a cada lado de las vértebras y la lámina se despega cuidadosamente para exponer la médula espinal........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1x PBS	Tecnologías de la Vida	#10010023	Tampón de disección
1x HBSS	Tecnologías de la Vida	#14175095	Tampón de disección
D-glucosa	sigma	# G-6152	Prepare una solución madre de glucosa al 30% para tampón de disección y mezcla de hormonas
Penicilina-Estreptomicina	Tecnologías de la Vida	#15140-148	Tampón de disección y medio de cultivo
Neurobasal-A	Tecnologías de la Vida	#10888-022	medio de cultivo
L-glutamina, 200 mM	Tecnologías de la Vida	#25030-081	medio de cultivo
B27	Tecnologías de la Vida	#12587010	medio de cultivo
DMEM	Tecnologías de la Vida	#11885084	Mezcla de hormonas
F12	Tecnologías de la Vida	#21700-075	Mezcla de hormonas
NaHCO3	sigma	# S-5761	Prepare una solución madre de NaHCO3 al 7,5% para la mezcla de hormonas
HEPES	sigma	#H9136	Preparación de la solución madre HEPES de 1M para la mezcla de hormonas
insulina	sigma	#I-5500	Mezcla de hormonas
Apo-transferrina	sigma	#T-2252	Mezcla de hormonas
putrescina	sigma	# P7505	Mezcla de hormonas
selenio	sigma	#S-9133	Mezcla de hormonas
progesterona	sigma	#P-6149	Mezcla de hormonas
EGF, ratón	sigma	#E4127	Preparar caldos de 100 μg/ml en B27 y alícuota; Medio EFH
bFGF: recombinante humano	sigma	#F0291	Preparar caldos de 100 μg/ml en B27 y alícuota; Medio EFH
Heparina, 10.000 U	sigma	#H3149	Preparar existencias de 27,3 mg/ml en mezcla de hormonas y alícuota; Medio EFH
Kit de disociación de papaína	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contiene EBSS, papaína, DNasa, inhibidor de la proteasa ovomucoide con BSA
Pentobarbital sódico	Bimeda – MTC Salud Animal Inc	DIN 00141704
Pinzas de tejido: Addisons	Herramientas de Bellas Ciencias	#11006-12	Punta estándar dentada; micropunta también disponible
Pinzas finas: Dumont #4	Herramientas de Bellas Ciencias	#11241-30
Microtijeras	Herramientas de Bellas Ciencias	#15024-10	Vannas de mango redondo
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
Placas de Petri de 10 mm	Nunc	Año 1501
Matraces de cultivo T25	Nunc	156367
Placas de 6 pocillos	Nunc	CA73520-906