$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
>1. Preparación de tampones de disección y medios de cultivo
- Para el aislamiento de la médula espinal de rata, prepare 100 ml de tampón de disección (1x PBS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigere.
- Preparar 100 ml de medio sin suero (SFM) y calentar a 37 °C. Para preparar SFM, agregue 2 mM de L-glutamina, 100 μg/ml de penicilina-estreptomicina, 2% de B27 y 10% de mezcla de hormonas al medio Neurobasal-A. Para preparar la mezcla de hormonas, prepare un medio DMEM/F12 1:1 que contenga 0,6% de glucosa, 3 mM de NaHCO3, 5 mM de HEPES, 25 μg/ml de insulina, 100 μg/ml de apotransferrina, 10 μM de putrescina, 30 nM de selenio y 20 nM de progesterona.
- Prepare el medio de siembra enriquecido con factor de crecimiento EFH (para SFM, agregue 20 ng/ml de EGF, 20 ng/ml de bFGF y 2 μg/ml de heparina) y caliéntelo a 37 °C.
>2. Recolección y disección de tejido de la médula espinal periventricular de rata adulta
- Esterilice los instrumentos de disección en etanol y enjuague con solución salina estéril o instrumentos de autoclave con anticipación. Administre a las ratas (de 6 a 8 semanas de edad) una inyección letal de pentobarbital sódico (1 cc a 65 mg/ml) o una sobredosis de anestésico (es decir, isoflurano al 4%) de acuerdo con el protocolo animal aprobado por la institución. Rocíe el lomo de la rata con etanol al 70% y retire la piel de la superficie dorsal con unas tijeras de disección grandes.
- Sosteniendo las tijeras perpendicularmente a la superficie dorsal, corte transversalmente la columna vertebral por encima de las extremidades posteriores. Use tijeras más pequeñas para cortar longitudinalmente el músculo dorsal que recubre la columna vertebral en dirección rostral para exponer las apófisis espinosas.
- Comenzando en el extremo caudal expuesto, inserte rongeurs o un pequeño instrumento de corte óseo romo extradural en la cara lateral del canal espinal en el espacio entre la médula espinal y la columna vertebral. Haga pequeños cortes en la lámina (arcos óseos a la izquierda y a la derecha de las apófisis espinosas a cada lado de las vértebras) y retire cuidadosamente la lámina para exponer la médula espinal (Figura 1A-D). Asegúrese de que el ángulo de las cuchillas sea poco profundo y paralelo a la médula espinal para que la médula espinal subyacente no se dañe.
- Continuar la laminectomía en dirección rostral para exponer la médula espinal torácica y cervical.
- Extraiga suavemente la médula espinal de la columna vertebral con pinzas de tejido romo y use microtijeras para cortar cuidadosamente las raíces y liberar el cordón. Colocar la médula espinal extirpada en una placa de Petri que contenga 4 °C de tampón estéril para disección de ratas (descrito anteriormente en el punto 1.1). Enjuague el tejido con un tampón de disección a 4 °C recién preparado y corte la médula espinal transversalmente en segmentos de 1 cm con unas tijeras (Figura 1E).
- Para cada segmento de tejido, use una mano para sostener el tejido con pinzas finas. Con la otra mano, use microtijeras para eliminar cuidadosamente las meninges suprayacentes, la materia blanca y la mayor parte de la materia gris con la ayuda de un telescopio de disección. Alternativamente, use pinzas finas (Dumont # 4) para pelar la mayor parte de la materia gris y blanca, dejando solo la región periventricular de la médula espinal que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante (Figura 1F-H).
- Agrupe el tejido periventricular disecado en una placa de Petri estéril de 10 cm que contenga tampón de disección de ratas frías.
>3. Aislamiento y cultivo de NSPCs de la médula espinal de rata adulta
- Realice los siguientes pasos de forma aséptica en una campana de flujo laminar.
- Picar el tejido periventricular de rata disecado en trozos de 1 mm con unas tijeras.
- Disociar enzimáticamente el tejido picado con enzimas proteolíticas utilizando el kit de disociación de papaína como se indica en la tabla de materiales/reactivos.
nota: Los componentes del reactivo incluyen cuatro viales: Vial 1: Earle's Balanced Salt Solution (EBSS). Vial 2: Papaína que contiene L-cisteína y EDTA. Vial 3: Desoxirribonucleasa I (DNasa). Vial 4: Inhibidor de la proteasa ovomucoide con albúmina sérica bovina (BSA).
NOTA: La papaína es una proteasa sulfhidril con amplia especificidad para sustratos proteicos. La papaína aquí contenida se deriva del látex de la planta de papaya Carica y degrada la mayoría de los sustratos proteicos más extensamente que las proteasas pancreáticas. Durante el proceso de disociación, hay algún daño celular que hace que el ADN se libere en el medio de disociación, lo que aumentará la viscosidad y dificultará el pipeteo. Por lo tanto, la DNasa se incluye en el procedimiento de aislamiento celular para digerir el ADN sin dañar las células intactas. Los ovomucos son inhibidores de la glicoproteína proteasa que se utilizan para inhibir la actividad de la papaína después de la etapa de disociación.
- En el primer uso, reconstituya la mezcla de inhibidores ovomucoides de albúmina (vial 4) con 32 ml de EBSS (vial 1) y, a continuación, almacene a 4 °C y utilícelo para aislamientos posteriores. nota: Esto produce una solución a una concentración efectiva de 10 mg de inhibidor ovomucoide y 10 mg de albúmina por ml.
- Añadir 5 ml de EBSS (vial 1) al vial de papaína (vial 2), produciendo una solución a 20 unidades de papaína/ml en L-cisteína 1 mM con EDTA 0,5 mM. Verifique que la solución de papaína parezca clara cuando esté completamente disuelta. De lo contrario, coloque el vial en un baño de agua a 37 °C durante diez minutos hasta que la papaína se disuelva por completo para asegurar la actividad total de la enzima.
- Añada 500 μl de EBSS (vial 1) al vial de DNasa (vial 3) y mezcle suavemente, ya que la DNasa es sensible a la desnaturalización por cizallamiento. Añadir 250 μl de la solución de DNasa al vial de papaína, dando como resultado una concentración final de aproximadamente 20 unidades/ml de papaína y 0,005% de DNasa. Guarde la ADNasa restante para usarla más tarde.
- Coloca el pañuelo de rata picado en la solución de papaína.
- Incubar a 37 °C con agitación constante sobre una plataforma basculante para disociar el tejido en la solución de papaína activada. Incube el tejido de rata durante 45 minutos a 1 hora.
- Triture la mezcla con una pipeta de 10 ml para disociar los trozos de tejido restantes y producir una suspensión celular turbia. Transfiera la suspensión celular (no incluya ningún trozo de tejido no disociado) a un tubo cónico estéril de 15 ml y centrifugue a 300 x g durante 5 min en RT.
- Vuelva a suspender las células peletizadas en un medio que contenga ovomucoide, un inhibidor de la papaína.
- Prepare la solución ovomucoide mezclando 2,7 ml de EBSS (vial 1) con 300 μl de la solución reconstituida de inhibidor de la albúmina y ovomucoide (vial 4) en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 150 μl de solución de DNasa (vial 3).
- Deseche el sobrenadante de las células peletizadas y vuelva a suspender inmediatamente el pellet celular en la mezcla diluida de DNasa e inhibidor de la albúmina.
- Separe las células intactas de las membranas celulares por centrifugación a través de un gradiente de densidad discontinuo de un solo paso.
- Prepare el gradiente de densidad discontinua añadiendo 5 ml de solución de inhibidor de la albúmina (vial 4) a un tubo de 15 ml y, con una pipeta de 5 ml, coloque suave y lentamente la suspensión celular (preparada como se ha descrito anteriormente) sobre la solución de inhibidor de la albúmina.
- Centrífuga a 70 x g durante 6 min a RT.
nota: La interfaz entre las dos capas del degradado debe ser claramente visible, aunque una mezcla mínima en este límite no afecta al resultado. Los fragmentos de membrana permanecen en la interfaz y las células disociadas se granulan en el fondo del tubo.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de medio EFH de rata (precalentado a 37 °C). Cuente la densidad de células vivas con un hemocitómetro y coloque las células en un matraz de cultivo T25 a una densidad de 10 células/μl en EFH. El rendimiento típico de células de tejido de rata es de aproximadamente 2 x 106 células con aproximadamente un 80% de viabilidad. Si se desean cultivos clonales, se deben sembrar células a una densidad inferior a 10 células/μl. Incubar los matraces a 37 °C con 5% de CO2 y dejar que los cultivos crezcan inalterados durante 1 semana para evitar la agregación de esferas.
