Aislamiento y cultivo de pericitos cerebrales de ratón

Resumen

Fuente: Mehra, A., et al., Un método de alto rendimiento para aislar pericitos cerebrales de ratón. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra un método para aislar pericitos cerebrales del cerebro de un ratón. Las células aisladas se cultivan en medios específicos de pericitos para promover la proliferación de pericitos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación de soluciones

1. Prepare 500 mL de tampón de lavado A (WBA): 10 mM de solución HEPES en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Conservar a 4 °C.
2. Prepare 500 mL de tampón de lavado B (WBB): 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) con 10 mM de solución HEPES en HBSS. Conservar a 4 °C.
3. Prepare 300 mL de solución de dextrano al 30% en WBA mezclando la solución durante la noche a temperatura ambiente. Autoclave la solución a 110 °C durante 30 minutos antes de su uso. Después de esterilizar en autoclave, deje reposar la solución a temperatura ambiente durante 2-3 h. Almacene la solución a 4 °C.
4. Prepare 100 mL de solución de BSA al 0,1% en solución fría de dextrano. Agitar enérgicamente durante 3-4 min y conservar a 4 °C.
5. Prepare el medio de cultivo completo Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) disolviendo 20% de suero de ternera, 2 mM de glutamina, 50 μg/mL de gentamicina, 1% de vitaminas, 2% de aminoácidos Basal Medium Eagle (BME) en medio Basal DMEM y almacene a 4 °C. Agregue 1 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) antes de usar.
6. Prepare el medio de pericito completo añadiendo suplementos de crecimiento de pericitos (suministrados con el medio de pericitos) y un 20% de suero de ternero fetal (FCS) en medios basales de cultivo de pericitos y almacene a 4 °C.

>2. Recuperación del tejido cerebral y extirpación de meninges

1. Para mantener la consistencia, use ratones de edad y sexo similares en cada lote de extracción. Utilice un refugio de animales libre de patógenos y proporcione acceso ad libitum al agua. Para garantizar la eficiencia y el uso mínimo de los animales, evite la pérdida de material tisular.
2. Sacrificar ratones machos C57BL/6J, de 4-6 semanas de edad (Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, Francia).
3. Extirpe rápidamente el tejido cerebral en condiciones estériles, evite cualquier daño al tejido. Coloque con cuidado el tejido en 40 ml de solución salina tamponada con fosfato frío (PBS).
4. Transfiera el tejido cerebral en PBS frío a una placa de Petri (100 mm x 15 mm).
5. Coloque el tejido cerebral en una toallita estéril y seca sin pelusa y, con pinzas de punta curva, extraiga el cerebelo, el cuerpo estriado y los nervios occipitales.
   1. Retire todas las meninges visibles con un bastoncillo de algodón. Coloque el tejido cerebral boca abajo y abra los lóbulos con un hisopo de algodón con movimientos ligeros hacia afuera. Extirpa todos los vasos sanguíneos visibles.
   2. Coloque el tejido cerebral libre de las meninges en una placa de Petri (100 mm x 15 mm) con 15 mL de WBB frío.

>3. Homogeneización

1. Transfiera el tejido a un tubo de mortero triturador de tejidos Dounce y agregue 3-4 mL de WBB con pinzas.
2. Picar el pañuelo con un mortero "suelto" 55 veces. Enjuague el mortero "suelto" con WBB. Ahora pica la lechada con un mortero "apretado" 25 veces.
3. Divida la suspensión en partes iguales en dos tubos de 50 ml y añada 1,5 veces el volumen de BSA-dextrano frío al 30%, agitando vigorosamente los tubos para mezclar la suspensión.

>4. Aislamiento de la fracción vascular

1. Después de agitar vigorosamente los tubos, centrifugar los tubos durante 25 minutos a 3.000 x g y 4 °C.
2. Transfiera el sobrenadante (junto con la capa superior de mielina) a 2 tubos nuevos y centrifugue los tubos durante 25 minutos a 3.000 x g y 4 °C. Conserve los pellets de la primera centrifugación añadiendo 3 mL de WBB frío (mantenga el pellet a 4 °C).
3. Repita el paso 4.2 y conserve cuidadosamente los gránulos de la 2ª centrifugación.
4. Deseche el dextrano y la mielina con los restos de tejido de los tubos del paso 4.3. Conservar los pellets en WBB frío.
5. Agrupar el contenido del tubo 1 y del tubo 2 del paso 4.1 y completar hasta un volumen final de 10 ml con WBB frío.
6. Repita este paso para los tubos de los pasos 4.2 y 4.3.
   NOTA: Por último, hay 3 tubos de 3 centrifugaciones.
7. Disocie el pellet con 6 movimientos hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 ml hasta que no queden grumos visibles de pellets.
8. Filtre las suspensiones celulares de cada tubo utilizando un conjunto de filtro de vacío y un filtro de malla de nylon.
   nota: Este paso de filtración es importante para eliminar recipientes más largos/grandes a través del filtro de malla.
9. Recupere y vuelva a suspender los capilares raspando el filtro con la ayuda de una pinza de punta plana o un raspador en WBB a temperatura ambiente. Filtrar la suspensión con un filtro nuevo para recuperar más capilares
10. Divida el filtrado en partes iguales en dos tubos y centrifugue durante 7 min a 1.000 x g y RT.
    NOTA: Durante este paso de centrifugación, prepare la solución enzimática. Determine el volumen de WBB requerido de acuerdo con el número de animales utilizados (ver Tabla de Materiales). Agregue 1x de DNasa 1 y 1x de clorhidrato de tosil-L-lisil-clorometano (TLCK) (ver Tabla de Materiales) en WBB y precaliente a 37 °C.
11. Recoja los gránulos del paso 4.10 en un tubo con WBB precalentado con enzimas. Añadir 1x colagenasa/dispasa precalentado. Coloque el tubo en el baño de agua de la mesa vibratoria a 37 °C durante exactamente 33 minutos.
12. Detenga la reacción enzimática agregando 30 mL de WBB frío. Centrifugar la suspensión durante 7 min a 1.000 x g y RT.
13. Deseche el sobrenadante con cuidado y disocie el pellet en WBB con 6 carreras hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 mL. Este paso debería ser menos riguroso y comparativamente más rápido.
14. Centrifugar la suspensión durante 7 min a 1.000 x g y RT.
    NOTA: Durante este paso, deseche el recubrimiento de las placas de cultivo y enjuáguelas una vez con DMEM a temperatura ambiente. Cubra las placas de cultivo celular durante al menos 1 h a RT.
15. Deseche el sobrenadante del tubo obtenido en el paso 4.14 y disocie el pellet en un nuevo medio DMEM completo, coloque las células (Día 0, P0) en 9 pocillos de placas de 6 pocillos (1 pocillo de 9,6 cm2 cada uno).

>5. Proliferación de pericitos cerebrales

1. Mantener los cultivos celulares a 37 °C y 5% de CO₂ en una incubadora estéril. Reemplace el medio de cultivo después de 24 h (día 1) de siembra de las celdas retirando cuidadosamente los desechos. A partir del día 1, cambiar el medio de cultivo cada 48 h.
2. Observe el cultivo celular durante al menos 7-8 días. En este momento, los crecimientos celulares en la parte superior de la unicapa endotelial deberían ser observables.
3. Pase de las células en el día 8-10 (dependiendo de la confluencia) en medio de cultivo de pericitos al paso 1 (P1) en placas de cultivo recubiertas de gelatina. Cambie el medio de cultivo cada 2 días. Observe las células durante 6-7 días. Las células se dividen consecutivamente de nuevo en el pasaje 2 (P2) el día 17 [y el pasaje 3 (P3) en el día 24 solo si es necesario], cultivadas en medio pericitario en placas recubiertas de gelatina
   nota: Las células deberán estar listas para experimentos/observación con una confluencia de casi el 80-90%.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aminoácidos BME	sigma	B-6766	Conservar a 4 °C.
Medios DMEM basales	Invitrogen	316000083	Conservar a 4 °C.
Factor básico de crecimiento de fibroblastos	sigma	F-0291	Conservar a -20 °C.
Bsa	sigma	A-8412	Conservar a 4 °C.
Colagenasa dispasa	sigma	10269638001	Prepare una solución madre 10x en PBS-CMF estéril. Filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm y guárdela a -20 °C. Nota: Para la etapa de digestión enzimática del protocolo, por cada conjunto de 10 ratones para la extracción, se requieren 300 μL de 10x colagenasa dispasa.
dextrano	sigma	31398
DNasa I	sigma	11284932001	Prepare una solución madre 1000X disolviendo 100 mg en 10 ml de agua estéril y almacene a -20 °C.
gelatina	sigma	G-2500	Prepare el recubrimiento de trabajo haciendo una solución de gelatina al 0,2% en PBS-CMF estéril (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 0,2 g/L de KH2PO4, 2,86 g/L de NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Esterilizar la solución en autoclave durante un mínimo de 20 minutos a 120 °C y almacenar a temperatura ambiente. Las placas de cultivo se recubrirán durante al menos 4 horas a 4 °C.
Gentamicina	Biochrom AG	A-2712	Conservar a 4 °C.
glutamina	Merck	I.00289	Conservar a -20 °C.
HBSS	sigma	H-8264	Conservar a 4 °C.
HEPES	sigma	H-0887	Conservar a 4 °C.
Matrigel	BD Biocoat	354230	Prepare una solución de recubrimiento de trabajo de Matrigel diluyendo el material en DMEM frío en una proporción de 1:48 con una concentración final de 85 μg/cm2. Las placas de cultivo celular deben recubrirse al menos durante 1 hora a temperatura ambiente.
Pericito Ratón mediano	Laboratorios de investigación Sciencell	Año 1231	Conservar a 4 °C.
Tosil lisina clorometilcetona	sigma	T-7254	Prepare una solución madre 1000X en WBA disolviendo 16 mg en 10,88 mL de WBA para hacer una solución de 4 mM y almacene a 4 °C.
vitaminas	sigma	B-6891	Conservar a -20 °C.
Herramientas de filtración	Sefar, malla de nylon, porosidad de 60 micras
equipo de laboratorio	Centrífuga de rotor de cangilón oscilante
Baño de agua con agitador
Campana de flujo laminar : BSL2
Cristalería (todos los componentes deben esterilizarse con calor)	Molinillo de pañuelos Dounce con mortero de vidrio
Maja I: 0.0035 - 0.0065 pulgadas
Maja II: 0.0010 - 0.0030 pulgadas
Conjunto de filtro de vacío con base de soporte de filtro de vidrio fritado de porosidad gruesa